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猪附红细胞体分子诊断与致病机理的研究

贾杏林

  本文重点对猪附红细胞体的分子诊断、猪附红细胞体病的发病原因、动物模型及新的传播途径和发病机理进行了初步研究,研究主要包括以下几个方面:1.猪附红细胞体的分子诊断研究:参照国外分子生物学诊断E.suis的文献合成引物,从患病猪和临床健康猪的血液中提取病原DNA,进行PCR扩增,扩增出781bp的片段,该片段经过克隆、双酶切鉴定和测序及序列比较,与国外E.suis同源性为99.4%,与Gene bank中其它已知序列无同源性,用同样的条件从巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌、羊鞭虫、牛巴贝斯焦虫、弓形体、沙门氏菌、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒基因组及SPF猪血中未扩增出相同的序列。进一步对山东省3个有猪附红细胞体病临床症状的患病猪场和5个临床健康猪场各取5份猪血进行了血涂片染色镜检和PCR诊断,结果吻合,该试验从分子生物学水平表明我国存在着E.suis,与国外报道为同一病原,且在山东省的存在非常普遍。2.猪附红细胞体解离诊断方法的研究:加入解离液(EPJL-1)前,血涂片用姬姆萨染色后置400倍光镜下观察,被猪附红细胞体寄生的红细胞变形,E.suis在红细胞周围染成紫红色小点。加入解离液(EPJL-1)后作用0.5-1min,红细胞恢复原来的形态,周围看不到紫红色小点。用该方法检测了10份PCR和涂片镜检阳性血清和一份阴性血清,结果符合。3.猪附红细胞体病动物模型及新的传播途径的研究:豚鼠分为对照、攻毒组、隔离组和接触组4组,每组各4只。小白鼠分为对照、攻毒组、隔离组和接触组4组,每组各6只。攻毒后观察发病情况,结果攻毒组豚鼠、隔离组豚鼠和接触组豚鼠发病死亡,诊断为E.suis致病,对照组豚鼠和小白鼠均正常。初步表明豚鼠可作为该病的动物模型,初步认为空气和接触可以传播该病。4.猪附红细胞体病病理学研究:取猪附红细胞体病患病猪和感染发病死亡豚鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、肠固定,制作病理切片,H.E染色,显微镜观察心、肝、脾、肺、肾出现出血和溶血性变化,胃、肠出现水肿和细胞坏死。5.猪附红细胞体病典型病例的疗程观察及血液学研究:猪附红细胞体病病猪出现高热、红皮等前期症状,白细胞增多;中后期皮肤发白,腹下和四肢皮肤发绀,白细胞减少,出现溶血性贫血,有急性死亡的情况,病程约10天左右,热型为稽留热。6.猪附红细胞体病发病原因初探:通过研究表明猪附红细胞体是一种典型的条件致病性微生物,低温、去势、不合格的疫苗注射和长途运输都可诱发猪附红细胞体携带猪发生该病。并在冬天进行了塑料大棚保温防制猪附红细胞体病的探索,效果较好。该研究初步解释了我国近几年猪附红细胞体病爆发及冬天无血源性传播媒介但发生该病的原因。7.猪附红细胞体引起淋巴细胞凋亡的研究:取猪附红细胞体病自然发病猪14头及临床健康猪5头猪血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳,发病猪血淋巴细胞出现细胞凋亡特异性的DNA Ladder,而临床健康猪淋巴细胞未出现DNA Ladder;同时淋巴细胞用乙醇固定后用流式细胞仪检测,发病猪淋巴细胞出现细胞凋亡峰,而临床健康猪淋巴细胞未出现细胞凋亡峰,初步表明该病原可以引起发病猪淋巴细胞出现细胞凋亡。提出E.suis病原引起淋巴细胞凋亡导致免疫抑制的假说。……   
[关键词]:猪附红细胞体;分子生物学诊断;流式细胞术;细胞凋亡;病程;发病原因;传播途径
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业大学2005年