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费氏中华根瘤菌RT19与耐盐有关基因的克隆和功能研究

姜巨全

  费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii) RT19是分离自天津盐碱地的快生大豆根瘤菌,能耐受高达0.6mol/LNaCl。本论文利用Tn5-1063a转座子对该菌株进行随机突变,建立了一个容量达30,000个突变株的库,从中筛选获得在0.4mol/L NaCl的FY培养基上不能生长的盐敏感突变株21株。利用Tn5-1063a能够自连成质粒和自我复制的功能,对突变株的基因组DNA进行酶切和自连,并对Tn5插入位置侧翼序列进行测序。结果发现,21株突变株是由于5个基因突变所致,它们是phaA2、phaD2、phaF2、phaG2和metH。其中,有8个突变株是因phaA2突变所致,7个突变株是因phaD2突变所致,2个突变株是因phaF2突变所致,2个突变株是因phaG2突变所致。另外,2个突变株是因metH突变所致。将与phaA2有关的突变株分别命名为RTa-1至RTa-8,将与phaD2有关的突变株分别命名为RTd-1至RTd-7,将与phaF2有关的突变株分别命名为RTf-1和RTf-2,将与phaG2有关的突变株分别命名为RTg-1和RTg-2,而将与metH有关的突变株分别命名为RTh-1和RTh-2。对pha2有关的4个基因及侧翼序列进行分析,发现它们与其它3个基因phaB2、phaC2和phaE2共同构成一个基因簇,并在同一个启动子的控制下进行转录。同源性分析显示,pha2基因簇分别与已经进行全基因组测序的苜蓿中华根瘤菌(S. meliloti)1021的编码不同的阳离子输出系统蛋白pha2基因簇有最高的同源性。此外,它们与已经完成全基因组测序的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacies)C58的编码多亚基的钠离子/氢离子逆向转运蛋白的mnh操纵子以及伯氏立克次氏体(Coxiella burnetii)RSA493的编码单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白nha基因簇也有相当高的同源性。对metH基因进行分析和同源性比较,发现它与苜蓿中华根瘤菌1021编码甲硫氨酸合成酶Ⅱ的基因有最高的同源性。对不同的无机离子和有机试剂对盐敏感突变株生长影响的测定结果表明,所有pha2突变株在0.1mol/L NaCl和LiCl的FY培养基上仍不能生长并且在含有高浓度KCl的FY培养基上表现出一定的生长抑制,说明pha2基因簇对费氏中华根瘤菌RT19的耐盐能力具有重要的作用。相比之下,metH突变株则在各种高浓度的渗透压力下都出现生长抑制现象。此外,当加入甲硫氨酸、胆碱以及甘氨酸甜菜碱时,能不同程度地恢复突变株在NaCl存在时的生长,这些表明metH基因可能与渗调机制有关。鉴于pha2基因共同构成一个基因簇,我们将其整体克隆到穿梭载体pBBR1-MCS5上,得到含有完整pha2基因簇的载体,将其命名为pMCS5-ZEd-1-ZCa-3。利用三亲本杂交技术,将pMCS5-ZEd-1-ZCa-3转入所有pha2突变株,结果使它们都完全恢复到原有的耐盐水平。将采取PCR方法克隆的metH基因连接到pBBR1-MCS5上,得到pMCS5-metH,然后通过三亲本杂交转入metH突变株,结果发现metH突变株在含有0.4mol/LNaCl的固体平板上恢复生长。为了证明pha2基因簇编码不同的阳离子输出蛋白,我们测试了RT19野生型和突变株的细胞内的离子含量,结果发现pha2突变株随时间的增加不断积累钠离子和锂离子,而不积累钾离子,这充分说明了pha2基因簇与钠、锂离子输出有关。由于该基因簇与编码多亚基的钠离子/氢离子逆向转运蛋白的mnh操纵子和编码单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白nha基因簇有很高的同源性,我们进一步测定了RT19野生型和突变株的单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白的活性,发现野生型……   
[关键词]:费氏中华根瘤菌;Tn5-1063;耐盐;单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白;甲硫氨酸合成酶Ⅱ
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业大学2005年