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樱桃主要病毒脱除和分子生物学检测技术研究

袁小环

  蔷薇科李属植物樱桃(Prunus avium, P. pseudocerasus)花、果兼美,不仅果实酸甜可口、营养丰富,还是优美的园林观赏树种。但是病毒的侵染使樱桃受害严重:生长势降低,枝、叶畸形,花、果减少。进行病毒脱除处理、推广无毒化栽培对提高樱桃的观赏价值和经济价值有重要的现实意义。严重危害樱桃的病毒主要有苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和李属坏死环斑病毒(PNRSV)两种。分别以‘6-7’和‘对樱’作为甜樱桃(P. avium)和中国樱桃(P. pseudocerasus)的代表品种研究ACLSV和PNRSV的脱除与检测方法。国内外没有对‘6-7’和‘对樱’两个品种进行过病毒脱除研究,对樱桃其它品种的的病毒脱除多采取生物学或血清学方法检测其效果,现已证明分子生物学方法的检测灵敏度远远高于这两种方法,采用生物学或血清学方法检测脱毒结果有可能因植物体内病毒浓度低而出现假阴性的现象,得出错误的病毒脱除结论。本文系统的研究了感染樱桃的ACLSV和PNRSV的脱除及分子生物学检测方法,为生产应用提供可靠的指导。1.建立了甜樱桃品种‘6-7’的组织培养体系。WPM较F_(14)和MS更适于作为‘6-7’的初代基本培养基,培养基各成分最适组成为WPM+6-BA 0.5mg/L+GA 0.2mg/L+IBA 1.0mg/L;接种时间以三月下旬至六月初为宜。F_(14)最适于继代和增殖培养;连续在F_(14)培养基上长期培养(大于60d)容易造成植株生长势衰退,适时转移到MS培养基上可以起到恢复旺盛生长的效果。培养基1/2F_(14)+IBA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L获得最高生根率89.7%;本文设计的以岩棉作固相支持物的液体培养对促进‘6-7’组培苗生根具有显著效果。2.采用分子生物学方法RT-PCR(逆转录—聚合酶链式反应)技术检测病毒脱除效果。樱桃组织富含多糖和酚类物质,难以得到高质量的RNA,本文设计了一种新的RNA提取方法,具有如下优点:液氮研磨有效抑制内源RNA酶的活性;CTAB作裂解剂,经65℃水浴使蛋白变性容易去除;提取缓冲液中加入PVP和β-巯基乙醇可以防止植物组织中富含的酚类物质的氧化;PVP与酚类物质结合后经无水乙醇沉淀除去,避免后继使用的PCI中的酚削弱PVP对植物组织中的酚类物质的结合作用,同时发挥了PCI去除蛋白能力强的优点。采用该法从樱桃叶片中提取总RNA,整个过程及后继RT-PCR反应均不需使用RNasin,降低了检测成本。3.优化了ACLSV和PNRSV的RT-PCR检测体系。RT最优反应体系为:RTase 2.5U/μ L,Pc 0.05 μmol/L,dNTP 0.15mmol/L。PCR最优反应体系为:TaqE 0.04U/μL,引物0.16μmol/L,dNTP 0.15mmol/L。检测灵敏度为0.2ng/L(总RNA的浓度)。4.系统研究了微茎尖组织培养、恒温热处理、昼夜变温热处理、低温长期培养、化学药剂处理5种方法对ACLSV和PNRSV的脱除效果。综合考虑成(存)活率和脱毒率两个因素,认为低温长期培养优于热处理、热处理优于微茎尖组织培养方法,试验……   
[关键词]:病毒脱除;李属坏死环斑病毒;PNRSV;组培苗;ACLSV;分子生物学检测
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:北京林业大学2005年