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小麦耐盐体细胞杂种盐胁迫应答基因的分离、定位及其耐盐机理研究

单雷

  植物在应对逆境胁迫时,从时间、空间上构成了协调复杂的调控网络。多条信号转导途径参与了盐胁迫信号的应答,激活或抑制的下游效应基因包括与离子转运和重建离子平衡有关的基因、参与渗透保护物质生物合成的基因、与水分胁迫相关的基因和与细胞排毒、抗氧化相关的酶基因等。所有这些基因协调一致地发挥作用,维持植物的正常生长发育。利用不对称体细胞杂交技术可向小麦转移异源植物的耐盐性。本实验室以普通小麦(Triticum aestivum L.)济南177胚性悬浮细胞来源的原生质体为受体,野生耐盐近源植物高冰草(Agropyron elongatum Host Nevski)悬浮细胞系原生质体经紫外线照射后为供体,进行不对称体细胞杂交,在国际上首次获得了体细胞杂种后代株系。经过连续多年的实验室及大田耐盐实验,已筛选出耐盐新品种山融3号,在0. 3%~0. 5%的盐地种植可以高产。为了进一步研究耐盐体细胞杂种新品种山融3号的耐盐机理以及探明其耐盐性的遗传基础,本研究以山融3号和其亲本济南177为实验材料,利用mRNA差异显示技术和RACE技术,分离了两个盐胁迫相关的全长cDNA序列,并对其表达特征进行了分析。本文还利用SSR标记方法,定位了一个耐盐主效基因。主要研究内容及结果总结如下:1、 小麦体细胞杂交新品种山融3号盐胁迫应答cDNA差异表达分析本研究用银染mRNA差异显示技术分析了山融3号和其亲本小麦济南177在盐胁迫前后基因的差异表达情况。从盐胁迫诱导的耐盐体细胞杂种和其亲本小麦中共获得的差异表达cDNA片段106个,其中从根获得的差异片段87个,叶中获得的差异片段仅有19个。表明200mmol/L NaCl胁迫6hr-72hr间在根中差异表达的基因远远大于在叶中差异表达的基因。山东人学博_!:学位论文 通过Reverse Northern杂交筛选,获得了27个阳性片段,它们在盐胁迫下表达增强或受到抑制。从中选出10个候选片段进行序列分析,其中片段~1一1推测的氨基酸序列与过氧化物酶有较高的同源性;片段~j一与根毛缺陷基因邢舰夕有较高同源性:片段~j芍与小麦的多种胁迫下的表达序列均有较高同源性。这三个片段被选作下一步研究的重点。另外,从本实验结果也可以看出,盐胁迫还调动了蛋白质合成与代谢及其它的细胞排毒和细胞防御因子等方面基因的表达(wrsi-了、4柳wlis一了)。还有一些未知功能的基因还需进一步研究(wrsi一石、7、8和wlis一2)。 推测哪j一了片段编码Classln类过氧化物酶,Northern杂交进一步验证了甲厂£j一1基因在耐盐品种山融3号的根中受盐诱导,为胁迫早期应答基因。在亲本小麦济南177中未检测到该基因的杂交信号。因此,推测在体细胞杂种的耐盐机制中,过氧化物酶基因的活化和在盐胁迫下的早期表达,对于清除盐胁迫引起的细胞中q一及其他有毒物质的积累有重要作用。2、小麦山融3号盐胁迫应答基因一根毛缺陷基因月砚珍全长cDNA的克隆 根据获得的袱厂‘j一cDNA片段序列设计基因特异性引物,利用5’RACE技术,获得T小麦根毛缺陷3(沼似夕)基因的全长eDNA(GenBank登陆号为AY557340)。该eDNA长2800bp,含有一个编码804个氨基酸残基的开放阅读框。对推导的氨基酸序列的分析表明’,小麦RHD3在蛋白的氨基端含有两个在真核生物中保守的GTP结合基序GXXXXGKS和DXXG。另外,在蛋白的梭基端包含一个18氨基酸残基(FYLAVMFVVFLVGKAI卿)组成的跨膜结构域,通过对水稻、拟南芥菜和酵母该结构域的比对,均无同源性,暗示小麦房舰夕基因有其独特的调控方式。 小麦烈似夕基因在盐胁迫下的山融3号和济南177中,其转录均受到抑制.推测形似夕基因在盐胁迫下的表达下调,可能通过使液泡增大或更新减慢或停止,进一步调控植物细胞的增大,这一过程是植物对盐胁迫适应的结果,并非耐盐的表现。该基因在山融3号和其亲本济南177中具有相同的胁迫应答机制。3、小麦山融3号盐胁迫应答蛋白醉抑制剂相关基因盯泞了一全长cDNA的克隆及表达 分析 根据获得的甲厂sj一cDNA片段序列设计基因特异性引物,利用5’RACE技术,从小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品种山融3号中克隆了两个同源性很高的wrsi一J全长eDNA(wrsi一J一I,GenBank登陆号为AY549888:wrsi一J一2)。这两个eDNA编码由90山东大学博士学位论文个氨基酸残基组成的多肤,序列中含有10个保守的半胧氨酸残基,且在32一87位包含一个保守的BowB结构域,推测wrsi石编码BBI型蛋白酶抑制剂。 Northern杂交分析表明,wrsi一J基因在盐胁迫下的山融3号和济南177的根中表达增强,并且在胁迫12小时时表达量达到最高,其高表达量可持续两天:胁迫72小时表达量开始降低;胁迫96小时时,转录量基本与未胁迫时相同。 原位杂交定位分析表明,在山融3号盐胁迫的根尖成熟区内皮层细胞中有wrsi一J基因的表达,而在亲本小麦济南177根尖的相同部位未检测到杂交信号。众所周知,植物根尖组织的内皮层细胞对于控制根中矿质营养物质的转移和水分吸收具有特殊意义。推测wrsi一万基因在控制山融3号Na+由根尖皮层细胞进入木质部中起重要作用,并且与山融3号叶中保持较低的Na+含量和较高的K7Na+比密切相关。 本文还讨论了盐胁迫导致的根尖皮层细胞程序化死亡……   
[关键词]:小麦;高冰草;体细胞杂种山融3号;mRNA差异显示;5'RACE;盐胁迫应答基因;基因克隆;分子标记;耐盐分子机理
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东大学2005年