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抗HIV PR,CVB6麦拓莱霉素的分离、鉴定、活性及生物合成研究

王志平

  本论文从本实验室具有抗枯草芽胞杆菌的藤黄灰链霉菌 099 出发,围绕其发酵液中抗菌活性成分麦拓莱霉素的分离纯化、结构鉴定、生理活性筛选、急性毒性、生物合成途径、计算机辅助药物设计 SYBYL 软件的模拟计算等进行了研究。在抗枯草芽孢杆菌活性指导下,建立针对 099 发酵液中未知活性成分的分离手段,利用制备高效液相层析、大孔吸附树脂层析等方法成功分离到具有抗菌活性、结构新颖的先导化合物-麦拓莱霉素。采用高分辨快原子轰击质谱、多维高分辨核磁共振等现代波谱结构鉴定方法,鉴定出麦拓莱霉素为全新大环内酯结构。分子式为C32H44O9N2,分子量为 600.3,含有 1,4-二氧螺杂[2, 5]辛-6-烯结构单元和 2-氧杂-5-酰胺氮杂双环[3, 2, 2]壬烷结构单元。对麦拓莱霉素的活性筛选表明:(1)对变异链球菌、枯草芽孢杆菌具有显著活性,MIC分别为 1.25μg/ml和 0.25μg/ml。(2)抗HIV蛋白酶(HIV PR)活性IC50为39.8μg/ml。(3)抗Coxsackievirus B6 病毒(CVB6)活性IC50为 231.1μg/ml,安全指数为 2.88;优于阳性对照病毒唑(IC50为 569μg/ml,安全指数为 1.75)。小鼠急性毒性LD50显示麦拓莱霉素为低毒性成分,1707mg/kg (ip.);进行了13C稳定同位素(CH3-13COONa、13CH3-COONa、13CH3-13COONa)饲喂实验,判断出了麦拓莱霉素分子中碳骨架来源。标记后C-1、C-3、C-5、C-7、C-9、C-12、C-14、C-19、C-22、C-28 的13C-NMR自然丰度增加,ESI-MS同时加以分析佐证,说明它们来自标记的乙酸钠,确定麦拓莱霉素的碳骨架主要由 6分子乙酸以及 4 分子的丙酸活性单位构成,其余碳原子可能来自甲硫氨酸和葡萄糖衍生物。在已知麦拓莱霉素的生物合成途径基础上,对代表性的初级代谢产物-脂肪酸酯进行了有目的的分离,证明了该菌株中存在脂肪酸的代谢途径。利用计算机辅助药物设计 CADD 加以研究中,利用 SYBYL 软件对其结构进行分子力学模拟和计算:14 元内酯环发生了高度扭曲折叠,其中的六元杂环为椅式构象,另一六元环为船式构象;麦拓莱霉素的最低分子能量为 128KJ/mol。建立了麦拓莱霉素的多种分析检测方法,其中 HPLC 分析方法为:流动相:乙腈:水:异丙醇(65: 35:2);0.3 ml/min 流速,254nm 检测波长,麦拓莱霉素峰经质谱和二极管阵列(PDAD)检测,证明为单一峰组分。检测方法在 0.3-500μg/ml范围具有良好的线性、精确性、准确性和回收率。……   
[关键词]:麦拓莱霉素;活性跟踪下分离纯化;结构鉴定;抗 HIV 蛋白酶;抗CoxsackievirusB6;液质联用;急性毒性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:天津大学2004年