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精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究

潘继承

  精氨酸激酶(ATP:N-精氨酸磷酸转移酶 EC 2.7.3.3)存在于无脊椎动物中,它是参与细胞代谢的磷酸激酶。以来源中国对虾的精氨酸激酶(40 kDa)为模式蛋白,研究蛋白质的折叠机制及其部分结构特征。利用内源荧光、ANS 荧光、远紫外—圆二色光谱、分子筛排阻层析以及酶活力测定等手段研究脲变性的精氨酸激酶在折叠过程中的平衡态中间体。第一个中间体(Ι)存在于脲溶液为 2.4— 3.0 M的浓度范围中;第二个中间体(N )存在于脲溶液为 0.4—0.8 M的浓度范围内。折叠动力学的结果表明:脲变性的精氨酸激酶的折叠呈典型的两相动力学过程。在精氨酸激酶去折叠的过程中,发生了脯氨酰异构现象,脯氨酰异构可能是折叠的限速步骤。上述结果表明:在脲变性的精氨酸激酶的折叠过程中,至少含有两个平衡态折叠中间体。根据上述研究结果, 提出了一个可能的精氨酸激酶折叠机制。胍变性的精氨酸激酶的复性率低且具有对蛋白浓度的依赖性。在低浓度下(=100 mM), 非离子去垢剂 Triton X-100 , Tween 20 不仅有效阻止聚沉而且可以帮助变性精氨酸激酶复性并可以溶解部分聚沉物,而这些被溶解的聚沉物再折叠成天然状态从而导致酶活性恢复的提高。动力学的结果表明:依赖于去垢剂存在一个诱导相,而聚沉的自复活不存在这个诱导相。在折叠过程中,表观活性的恢复与去垢剂分子之间存在协同作用。基于上述的研究结果,提出一个可能的折叠机制。利用底物反应的动力学理论研究 5,5-二硫二(2-氮苯甲酸)修饰的精氨酸激酶被二硫基苏糖醇还原的过程。结果暗示:该半胱氨酸可能处在精氨酸激酶两个结构域之间的绞链区。精氨酸激酶上可反应性半胱氨酸可能不仅参与底物过渡态的结合,还参与了其后酶构象的变化。氧化型的二硫基苏糖醇可以导致酶的构象变化。过渡态复合物可以诱导还原型、氧化酶型的精氨酸激酶的构象变化。分子筛排阻层析和 SDS-PAGE 凝胶电泳的结果显示:在氧化型二硫苏糖醇溶液中,蛋白分子之间没有形成二硫键。……   
[关键词]:精氨酸激酶;平衡态折叠中间体;聚沉;可反应半胱氨酸;复活动力学
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:清华大学2004年