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淹水稻田土壤微生物对镉污染毒性的生理生态反应及其抗性czcC基因的克隆与表达

段学军

  本项目以江西水稻土为研究材料,综合运用传统及现代分子生物学手段,采用室内培养、纯培养及统计分析相结合的方法,全面探讨了重金属镉胁迫对淹水稻田土壤的微生物生态及毒性效应,并筛选分离到一株镉抗性细菌,进行了抗性czcC基因的克隆与表达,为建立有效的重金属污染预警指标体系、环境质量评价及抗镉微生物的有效利用提供有益的参考。本研究所获主要结论如下:1.以江西黄棕稻田土为材料,采用室内培养方法,系统研究了不同程度的外源重金属镉胁迫对淹水稻田土壤可培养微生物特别是厌氧微生物种群多样性、土壤生物活性以及酶活性动态变化过程的影响,研究结果表明:不同浓度的镉胁迫对稻田土壤各微生物类群及土壤生化过程具有不同效应,低浓度镉对多种微生物种群有一定刺激作用,浓度提高则会对所有微生物产生抑制作用,其中好氧微生物以放线菌,厌氧微生物以以产甲烷细菌对镉最为敏感,厌氧固氮菌、产氢产乙酸细菌次之,反硝化细菌及厌氧发酵性细菌影响最小。与此相对应,对与厌氧微生物相关的生物活性的影响中,低浓度镉的添加对水稻田土壤生化作用强度具有一定刺激作用,高浓度则产生抑制,而且施药浓度越高,受抑制程度越强,其中对产甲烷活性的影响最大,硫酸盐还原活性次之,反硝化活性最小。在镉胁迫对土壤酶活性的影响方面,镉胁迫对供试土壤几种酶活性的影响强度顺序是脲酶>过氧化氢酶>转化酶>磷酸酶,上述各微生物指标与土壤镉含量的相关性分析表明,土壤放线菌、产甲烷细菌、厌氧固氮菌、产氢产乙酸细菌数量及土壤呼吸强度、产甲烷活性、硫酸盐还原活性、土壤脲酶、过氧化氢酶等生化活动强度与土壤全镉、有效镉含量之间呈现显著或极显著的负相关关系,能较灵敏的反应土壤重金属镉的污染状况,可以作为淹水条件下镉污染的生物学指标,为污染环境生物监测提供依据。根据以上微生物指标及主成分因子分析,获得本实验条件下,淹水稻田土壤微生物镉胁迫的临界指标为1~5mg/kg。2.在传统微生物污染生态研究基础上,运用分子生态学手段,建立了有效的土壤总DNA的提取方法,提取到满足PCR扩增的高质量的土壤总DNA,获得用于进行DGGE分子指纹分析的特异16S rDNA V3区扩增片段。并采用DGGE分子指纹技术,避开传统的分离培养过程,对重金属镉污染条件下稻田土壤微生物种群的基因多样性进行了初步研究。通过对不同培养时间、不同浓度镉胁迫淹水稻田土壤的微生物DNA进行DGGE基因多样性的分子指纹图谱分析,发现随着培养时间的不同,各处理间的土壤微生物基因多样性差异存在明显不中文摘要同,培养初期锅对土壤微生物种群毒害作用非常明显,导致大量条带消失,土壤微生物基因多样性卜降,但培养后期不同处理之间ONA基因型差异很小,但对种群丰度仍存在较大影响,OGGE技术可以用于污染环境下微生物多样性研究。首次发现在土壤培养中期、含锅3一lom眺g的!65:DNA DGGE电泳图谱中出现一条新增条带,为对照及锅浓度为lm眺g土壤所没有,说明土壤中可能存在适宜福浓度下良好生长的微生物种,经序列测定及与GenBank中核酸数据进行网上比对分析,与Uneuirured baeterium sP.具有96%的相似率,初步确定为一不可培养的、在合适锅污染环境中的特征性细菌,以其为材料研究淹水条件下锅污染的基因监测有一定的可行性。3.微生物纯培养生理毒性研究表明,不同微生物纯培养对镐胁迫的敏感程度不同,G+较G一对cd,十更为敏感,表现为世代时间缩短,最高菌浓度下降。固氮菌对cdZ+非常敏感,当cd,十含量为住Zm留L时即完全抑制菌体增殖。同时,外源福强烈的抑制作为稻田土壤中功能微生物的厌氧固氮菌及产甲烷细菌的生物活性,从微生物生长角度说明了锅对微生物的毒性效应。微生物在适应环境福胁迫的生理过程中需要调整细胞内的生理生化过程,以适应新的环境。各菌种福胁迫下细菌细胞内可溶性蛋白、还原糖、核酸含量均在低浓度镐胁迫时有所增加,随着镐浓度的增加,含量开始减小,以减慢细胞代谢速度,增强对锅胁迫的适应力,变化趋势为可溶性蛋白>还原糖>核酸含量,R.eutroPha DKcl由于抗性系统的作用,细胞内含物含量基本保持稳定。细菌细胞内含物对环境锅胁迫具有一定的应答反应,可在一定程度上说明福对微生物的毒性效应。锅胁迫对应激酶活性影响研究表明,不同浓度福对E.coliKrZ,刀.、u石212结B19和R.eul尸OP}ZaoKcl培养不同时间的SoD、CAT和ATp酶活性均有不同程度的诱导作用,表现在前期、低浓度时激活,后期、高浓度时抑制,体现了不同微生物间的差异,以及抗镐潜力的不同。3种指标间接地反映了环境中有毒有害物质的存在,且能在早期较灵敏地指示污染的影响,作为环境受到污染胁迫的细胞生化指标具有一定可行性。4.从长期重金属福处理土壤中分离纯化,获得一株可在含福35Om留L的培养基上正常生一长的抗福细菌菌株,编号为DKcl,通过对该菌株进行形态观察、Biolog生理生化分析、G+Cmolo/0测定及!65 r0NA序列同源性比较,鉴定为Ralstonia out厂opha;并利用心Pll数据库的Phylip Interface进行了系统发育地位分析,构建了进化树,抗性?……   
[关键词]:镉胁迫;淹水稻田土壤;微生物生态效应;基因多样性;毒性;Ralstonia eutropha;分离与鉴定;czcC基因;克隆与表达
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2004年