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伪狂犬病病毒宿主关闭蛋白的基因克隆、表达及其结构分析

马相如

  α疱疹病毒在感染细胞过程中,普遍产生对细胞内大分子合成的显著抑制作用,从而引起宿主细胞蛋白质合成的快速关闭。进一步研究发现单纯疱疹病毒1型中UL41基因编码的磷酸化蛋白与宿主细胞核糖核蛋白体的关闭和mRNA降解有关,该蛋白质被命名为病毒宿主关闭蛋白(virion host shutoff protein,VHS),是构成病毒颗粒的次要结构组分——间质蛋白。在病毒感染裂解期,VHS蛋白进入细胞后立即触发宿主细胞蛋白质合成的快速关闭和所有mRNA(包括宿主细胞及病毒)的降解,使细胞内蛋白质翻译从宿主mRNA转向病毒mRNA,并推动不同时期(立即早期α、早期β、晚期γ)病毒基因的有序表达。病毒感染后期,病毒结构蛋白VP16(由UL48基因编码)可以抑制VHS蛋白的活性,并将VHS蛋白包装进病毒颗粒。此外,许多研究表明VHS蛋白还是一个重要的毒力因子,通过干扰IFN-α/β介导的抗病毒免疫反应、降低宿主细胞MHC Ⅰ和Ⅱ类分子的表达、减少免疫系统中病毒抗原的提呈以及抑制宿主先天免疫反应等在α疱疹病毒的发病机理和免疫逃避过程中发挥重要作用。然而,目前关于伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)中VHS蛋白的研究却很少,尚不清楚其是否具有与其它α疱疹病毒VHS相似的生物学活性。因此,克隆并研究PRV的VHS蛋白基因不仅可以鉴定PRV中VHS蛋白的生物学特性,而且对于阐明PRV的基因表达与调控、发病机理及潜伏感染机制等都具有重要意义,并为今后开发VHS基因缺失疫苗奠定基础。本研究通过PCR从伪狂犬病病毒Ea株基因组中扩增到UL41全基因,序列测定发现扩增片段全长为1174bp,包含编码VHS蛋白365个氨基酸的完整编码区。序列比较分析发现VHS蛋白具有4个保守区,并且第三个保守区与核酸内切酶结构域FEN-1(1A76)高度同源.用PROSPECT软件预测的伪狂犬病病毒VHS蛋白三维结构中含有10个α螺旋和22个β折叠,与单纯疱疹病毒Ⅰ型的VHS蛋白三维结构十分相似。说明PRV的VHS蛋白可能也是一个核酸酶,具有mRNA降解活性。将UL41全基因克隆到表达载体pGEX-KG中GST下游,构建了原核表达质粒pGEX-UL41,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了GST-VHS融合蛋白的高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达的融合蛋白质分子量为66 KDa。将原核表达质粒pGEX-UL41和pGEX-UL48分别转化大肠杆菌,大量诱导表达融合蛋白VHS和VP16。提取包涵体,复性和纯化后免疫家兔,分别制备了抗VHS和VP16蛋白的高免血清。本研究还将UL41与UL48全基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)和pCI-neo中,构建了单基因真核表达质粒pcDNA-UL41,pCI-UL41和pCI-UL48,以及UL41与UL48双基因共表达质粒pcDNA-UL41-UL48。为进一步深入研究VHS蛋白的功能,确定其是否可以与VP16蛋白相互作用奠定了基础。……   
[关键词]:伪狂犬病病毒;病毒宿主关闭蛋白;克隆;表达;序列分析;结构预测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2004年