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猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

唐先春

  多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是一种重要的病原菌,按产毒素与否,可将其分为非产毒素多杀性巴氏杆菌(Non-toxingenic Pasteurella multocida,TPm)和产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxingenic Pasteurella multocida,T~+Pm)。T~-Pm往往导致猪肺疫、禽霍乱、牛羊出血性败血症等畜禽传染病;T~+Pm是猪传染性萎缩性鼻炎(Swine infectious atrophic rhinitis,AR)的主要病原菌。用特异性荚膜抗原可将Pm分为A,B,D,E和F 5个血清群(型);利用菌体抗原可将Pm分为1到16个菌体型。Pm的菌体最主要的外膜蛋白是OmpH,各血清型的OmpH蛋白同源性较高,而且能诱导高水平的保护性抗体。T~+Pm产生的多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)是一种约145kDa的皮肤坏死毒素,该毒素由toxA基因编码。T~-Pm缺少toxA基因,不能导致严重的萎缩性鼻炎症状,而只注射提纯的PMT就可以导致SPF猪出现萎缩性鼻炎症状。可见PMT在AR的产生过程中起着重要的作用。研究还表明:PMT与细胞结合并转入细胞的活性位点位于N端,而发挥毒性催化作用的位点在C端;PMT全毒素是有致病性的,而适当截短的PMT能失去致病性、保留免疫原性,可用于疫苗且比天然毒素易于获得。本研究针对Pm及PMT主要开展了以下工作:1、建立了猪多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法,应用该检测方法并结合细菌的生化试验,从临床样品中分离鉴定了66株Pm。其中24株分离于肺脏,42株分离于鼻拭子样品。同时对每一分离菌株进行了药敏实验。2、参照文献设计了5对PCR引物,它们是分别针对多杀性巴氏杆菌A、B、D、E、F 5个荚膜血清型的特异基因。从而建立了猪多杀性巴氏杆菌的PCR分型方法,用该方法对每一分离菌株进行了荚膜分型。结果表明,在分离的66株Pm中有46株为D型,18株为A型,1株为B型,1株无法定型,没有E、F型。在46株D型Pm中有28株分离于鼻拭子样品,18株分离于肺脏;18株A型Pm中有14株分离于鼻拭子样品,4株分离于肺脏:1株B型Pm分离于肺脏:1株未定型的Pm分离于肺脏。3、设计了一对特异扩增T~+Pm的toxA基因的引物,建立了产毒素多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法。用该方法对分离菌株进行了毒素检测,结果表明,所分离的66株Pm有8株为产毒素菌株。这8株T~+Pm都分离于有AR症状猪的鼻拭子样品,均为D型。4、参照GenBank已发表的多杀性巴氏杆菌ompH基因序列,设计了一对引物,华中农业大学硕士毕业论文通过PCR的方法,克隆了Pm的。mPH基因,以pMD18一T为载体,构建了克隆载体pMD一口仰H并进行了序列测定。比较分析表明,所克隆的口mpH基因与NcBI上所报道的7个。呷H基因序列:us琴208、u52200、u522一3、AJ4597s5、u522ox、工二丝匹、旦业塑互的大小完全一致,为1114bP。核昔酸同源性达到%%一99%。然后构建了原核表达载体PET-o即H,转化大肠杆菌B玩,,实现了口朋卯H基因在大肠杆菌BL2.中的高效表达。表达蛋白约35kDa,W七Stem一blot检测表明,表达的蛋白具有生物学活性。5、参照GenBank己发表的toxA基因序列,设计了一对带有酶切位点的引物,通过pCR的方法,克隆了完整的toxA基因(扩增片段为4024bp,o盯为3858bp)。构建了原核表达载体pET28b一toxA,并对其序列进行测定,比较分析表明,该才。工A基因与NCBI上所报道的5个toxA基因序列:225388、X57775、x52478、^J566llo、迷返工丝鱼的大小完全一致,核昔酸同源性都在99%以上。将表达载体pET28b一toxA转化大肠杆菌BLZ,,但是没有得到表达。然后,在质粒pET28b一toxA基础上,用酶切方法构建了4个亚克隆表达载体:①pET28b一N1513;②pET28a一1514C;③pET28b一N3 173;④pET28b一N3389,用于表达截短的toxA基因。分别转化大肠杆菌BLZ,,诱导表达。结果只有质粒①pET28b一1 513和②pET28a一1514C得到了表达,分别表达了toxA基因5’端的1 513个碱基和3’端的2345个碱基,二者相加正好是全毒素。表达蛋白分别约57kDa和87kDa,W七stem一blot检测表明,表达的蛋白具有生物学活性。本研究分离鉴定了66株Pm,其中8株是产毒素菌株,为进一步研究提供了材料:所建立的Pm鉴定、Pm分型、T+Pm鉴定方法有助于临床诊断及细菌分离;对口mPH基因的克隆表达为研制猪多杀性巴氏杆菌病的ELISA诊断方法和新型基因工程疫苗莫定了基础;才口义A全毒素基因的克隆以及剪切后毒素基因片段的表达为研制AR的EUSA诊断方法和亚单位疫苗奠定了基础。……   
[关键词]:多杀性巴氏杆菌;产毒素多杀性巴氏杆菌;药敏实验;毒素检测;荚膜分型;omPH;toxA;克隆表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2004年