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毕赤酵母植酸酶工程菌的改造及其初步发酵工艺研究

陈杏洲

  植酸酶是一类能将植酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌醇和无机磷酸的磷酸酶。因单胃动物如猪、鸡等的消化道内缺乏植酸酶,所以饲料中以植酸磷形式存在的磷很少能被生物利用。植酸酶的添加,不但能促进动物对饲料中磷的利用,同时还能降低植酸的抗营养作用,因而植酸酶引起了饲料行业的普遍关注。由于很难找到一种产酶量很高的天然产植酸酶菌株和植酸酶的热稳定性问题一直不能得到很好的解决,所以目前植酸酶在饲料中并没有得到广泛的推广和应用。本研究中设计并合成了三对引物。采用PCR的方法,分别以毕赤酵母Pichia pastoris GS115的总DNA、pPIC9K和pPIC9K-phyA为模板,扩增出启动子序列GAP.、信号肽序列SS和植酸酶基因phyA序列,再用融合PCR的方法将GAP、SS和phyA融合得到融合片断F_(GSP),用AatⅡ+EcoRⅠ双酶切F_(GSP)和pAO815,双酶切的产物连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性转化子得到重组表达质粒pAOGSP.酶切验证后,用电转化的方法,将重组表达质粒pAOGSP整合到毕赤酵母(Ppastoris)GS115的染色体上,经选择性培养基筛选,得到阳性重组子。经过以重组酵母总DNA为模板进行PCR扩增检测以及采用含有植酸钙的选择性培养基初步检测结果表明,植酸酶基因phyA在毕赤酵母中得到了分泌表达.摇瓶发酵的上清酶活在第4天达到了1397u/ml.而同时发酵工艺更为简单。……   
[关键词]:植酸酶;毕赤酵母;融合PCR;组成型表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2004年