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中国蚌科的遗传多样性与系统发育的研究

魏开建

  蚌科是淡水底栖动物的重要类群,由于淡水蚌类存在趋同现象,致使我国蚌科在分类上仍然存在许多争议。国内以往对淡水蚌类的研究主要侧重于资源调查以及生物学、形态学等方面,对蚌类的遗传学研究较薄弱,对其种群遗传结构和遗传多样性的研究十分缺乏。近年来随着湖泊、河流等内陆水域污染程度加剧、对蚌类栖息地的人为干预和资源的过度开发利用,在一定程度上对蚌类的种质资源造成破坏,一些经济蚌类的自然资源日益减少甚至濒临灭绝。因此,为了进一步了解不同种类的遗传多样性现状,从分子遗传学角度对我国蚌类的遗传多样性进行研究,探讨蚌科的分子系统发育关系是非常必要的。为此,本研究采用RAPD技术对我国10属18种蚌类20个群体的遗传多样性进行了分析,将RAPD标记与rDNAITSl序列分析、贝壳形态度量分析相结合对我国蚌科的系统发育进行了研究。主要结果如下:1.比较了2种酚-氯仿抽提法从淡水蚌类软体组织中提取基因组DNA的效果和适用性。结果表明,基于Sambrook的方法改进的DNA提取方法不仅步骤简单,而且提取的基因组DNA分子大、质量高,适合淡水蚌类基因组DNA的大规模提取。对比实验显示,闭壳肌和外套膜组织是蚌类基因组DNA提取的理想材料,经裂解液和酶类处理的组织悬液在55℃水浴中消化的时间以5~7h为宜,蛋白酶K浓度达到100~120gg/ml即可满足DNA的提取要求。2.以河南宿鸭湖圆顶珠蚌的基因组DNA为模板,对淡水蚌类RAPD反应体系中的模板DNA浓度、随机引物浓度、dNTPs浓度、Mg~(2+)浓度、Taq DNA聚合酶浓度和和热循环参数中的退火温度进行了优化。RAPD扩增的最佳反应体系为:在25μl反应体系中含10×Reaction Buffer 2.5μl,2.0mmol/L MgCl_2,0.1%Triton X-100,0.2mmol/L dNTPs,1.5U Taq DNA聚合酶,30ng模板DNA,0.2μmolfL(约15ng)随机引物。热循环参数为:94℃预变性4min;然后94℃变性1min,37℃退火1min,72℃延伸2min,共45个循环;最后72℃保温10min,反应结束后降温至4℃保存。3.采用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对我国蚌科10属20个种群的遗传多样性进行了分析。从OPI、OPP、OPG、OPM四组共80个随机引物中筛选出16个引物进行RAPD扩增,对RAPD扩增座位的多态性进行了分析。结果表明:不同种群RAPD扩增的多态座位百分率变化范围为34.5%~78.1%,Shannon遗传多样性指数平均值变化范围为0.1891~0.4233,群体内的平均遗传距离为0.0708~0.2169。在20个种群中,圆顶珠蚌的遗传多样性最大,橄榄蛏蚌的遗传多样性次之,两者的RAPD扩增多态位点百分率均大于70%。短褶矛蚌和河无齿蚌种群的多态位点百分率低于40%,其中短褶矛蚌的Sh~on遗传多样性指数为0.1891、群体内的遗传距离为0.0708,在所有种群中均最小。涨渡湖、宿鸭湖、都阳湖的褶纹冠蚌3个地理种群的多态座位百分率为622%~70.9%,Sh~on遗传多样性指数为0.3596~0.4041,种群内的遗传距离为0.1 540~0.1%9,3个种群之间的遗传距离为0.1931~0.2389,涨渡湖与宿鸭湖的种群之间有较近的亲缘关系。4.通过对蚌科10属21个种群的RAPD扩增,对我国蚌科的系统发育进行了分析。结果表明:我国的蚌科类群可隶属3个亚科,其中丽蚌属的薄壳丽蚌、背瘤丽蚌、洞穴丽蚌与帆蚌属、蛙蚌属的种类有较近的亲缘关系,建议归入小方蚌亚科(Ambleminae);冠蚌属和无齿蚌属的种类归入无齿蚌亚科(.A刀odoniinae);矛蚌属、扭蚌属、尖靖蚌属、楔蚌属和珠蚌属归入珠蚌亚科(Uni。苗nae)。绢丝丽蚌与丽蚌属的其它种因遗传距离较大发生分歧而成为较独特的一个分类群,建议将其从丽蚌属中独立出来,建立新属。圆背角无齿蚌与背角无齿蚌因遗传距离较大而互为姊妹种,建议恢复其太平洋无齿蚌的种名。扭蚌的2个表型群体仍属于同一种。5.对我国蚌科10属21个类群的核rDNA ITSI部分序列的变异进行了分析。结果表明:绢丝丽蚌的ITSI部分序列长度为84obP,其中第4~298bP区和第312一596bP区是核昔酸组成极为相似的二段重复DNA序列区;其他分类群的序列长度为494bP一609如。21个类群的平均序列长度为560bP,4种核昔酸T、C、A、G的平均组成频率分别为25.0%、253%、21.9%和27.8%。剪去绢丝丽蚌ITSI序列的312一5%饰区域后进行序列比对排列,序列总长度为675bP。经MEGA 2.1软件对序列进行分析,有443个变异位点,其中319个为简约信息位点。6.采用蚌科10属21个类群的核rDNA rrsl部分序列对我国蚌科的系统发育进行分析,并与国外蚌科的 ITSI序列进行了比较。结果表明:绢丝丽蚌与丽蚌属的薄壳丽蚌、背瘤丽蚌、洞穴丽蚌发生明显分歧而使丽蚌属分为2个类群。系统发育分析结果支持将帆蚌属、蛙蚌属以及丽蚌属的薄壳丽蚌、背瘤丽蚌、洞穴丽蚌归入小方蚌亚科:冠蚌属和无齿蚌属仍归属无齿蚌亚科;绢丝丽蚌与矛蚌属、扭蚌属、尖靖蚌属、.楔蚌属、珠蚌属划归在珠蚌亚科。绢丝丽蚌与其它3种丽蚌因亲缘关系较远而分属珠蚌亚科和小方蚌亚科。7.根据贝壳的6个形态性状对我国蚌科11属25种蚌类33个种群的形态变异进行主成分分析。对无齿蚌属、冠蚌属和帆蚌属9种蚌14个种群的分析结果为:第一主成分受5个性状的?……   
[关键词]:中国蚌科;DNA提取;RAPD;反应条件优化;遗传多样性;rDNA ITS1;序列;系统发育;判别分析
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2004年