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杂交扇贝(华贵栉孔扇贝Chlamys nobilis ♀×栉孔扇贝C.farreri ♂)的分子细胞遗传学分析

毕克

  本研究对华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)♀×栉孔扇贝(C.farreri)♂单对杂交的受精过程以及杂交子代幼虫的核型进行了分析;首次将基因组原位杂交(Genomic in situ hybridization GISH)技术应用到扇贝的杂交分析中;构建了一种针对于这两种扇贝的种特异性探针,结合实践探讨了荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)在贝类杂种鉴别中的应用前景。结果如下:1.利用HOECHST33258荧光染料对华贵栉孔扇贝♀×栉孔扇贝♂受精过程以及子代早期胚胎发育进行了观察分析,以验证利利用这两种扇贝进行人工杂交的可行性。结果表明华贵栉孔扇贝的成熟卵子处于第一次减数分裂的前期或中期,来自于栉孔扇贝的部分异源精子可以附着并进入华贵栉孔扇贝的成熟卵子,激活卵子恢复并完成两次减数分裂并依次排放出第一及第二极体,精卵原核完全形成后在卵子细胞中央位置完成融合。精卵原核的融合以及早期胚胎进行正常发育证实了异源精子参与了后代遗传物质的组成。2.对华贵栉孔扇贝♀×栉孔扇贝♂子代担轮期幼虫以及双方亲本扇贝进行了常规核型分析。结果表明亲本扇贝基因组染色体之间无论从数目还是到形态上均存在着明显的差别。70%以上的杂交子代担轮幼虫期的核型为2n=35=6m+5sm+11st+13t,NF=46,符合杂交的理论预期价值。本研究进一步证明了亲本双方的遗传物质参与了大部分子代基因组的构建。3.探讨了GISH技术应用到贝类基因组研究的可行性。对GISH在扇贝基因组研究的应用条件进行了优化处理。摸索出了一套适合贝类杂种基因组分析的GISH技术流程。并利用优化后的GISH方案对华贵栉孔扇贝♀×栉孔扇贝♂子代幼虫进行了检测,结果表明子代中超过70%的分裂相含有35条染色体。利用华贵栉孔扇贝基因组探针作杂交,FITC-PI作为信号检测系统时,分裂相中有16条染色体被稳定地涂染成绿色,正符合华贵栉孔扇贝亲本染色体的单套数目(n=16);利用栉孔扇贝基因组探针作杂交时,分裂相中有19条染色体被涂染成绿色,这也符合栉孔扇贝亲本染色体的单套数目(n=19)。结合前面我们对同批杂交子代的常规核型分析结果,我们可以确定到担轮期时,大多数的子代仍然符合理论预期型(2n=6m+5sm+11st+13t),即其基因组染色体是由亲本扇贝基因组单毕克中国海洋大学硕士论文套染色体构成的。实验中我们没有发现明显的染色体丢失、断裂及重组等现象,也没有发现单倍型的染色体分裂相(n二16或n二19)的出现。4.发现在华贵栉孔扇贝早又栉孔扇贝占过程中产生了极少数的雌核发育个体。对杂交的受精生物学观察分析探测出了2一4%的来自于华贵栉孔扇贝的卵子仅通过栉孔扇贝精子的外部刺激即可完成成熟分裂。常规核型分析探测出子代中约2%的分裂相染色体组型与华贵栉孔扇贝核型完全一致。利用GISH对这部分个体进行检测鉴定,结果表明其分裂相染色体能够完全被华贵栉孔扇贝基因组DNA探针所涂染。综合三方面的结论,我们推测这两种扇贝在进行人工远源杂交的过程中,通过某种未知的机制诱发产生了部分雌核发育个体。5.探讨了FISH技术和种属特异性探针在扇贝杂种鉴别中的实际应用。根据栉孔扇贝和华贵栉孔扇贝转录间隔区I(ITSI)之间的变异度,设计了适当的FISH杂交温度和洗脱严紧度,构建了针对这两种扇贝的种特异性探针。FISH的结果表明,在当前的洗脱条件下,利用栉孔扇贝ITSI探针进行FISH能够在栉孔扇贝种内近交子代中检测到两簇较强阳性信号位点;在华贵栉孔扇贝早X栉孔扇贝古子代幼虫中只能够检测到一簇较微弱的阳性信号;而在华贵栉孔扇贝种内近交子代中没有检测到明显的阳性信号。本研究成功地将FISH技术应用到华贵栉孔扇贝早X栉孔扇贝占杂种鉴定当中,证明利用FISH与种属特异性探针在贝类的杂交育种研究中将会具有广阔的应用前景。……