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栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒基因克隆及核酸诊断技术的建立

艾海新

  自1997年以来山东沿海暴发栉孔扇贝(Chlamys farreri)大规模死亡现象,给我国贝类养殖业造成了巨大的损失,通过流行病学调查、病理学分析和人工感染实验已经证实是由栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒(AVNV)造成的。本研究利用差速离心和蔗糖密度梯度离心分离纯化AVNV后,用蛋白酶K裂解法抽提AVNV核酸,并对AVNV核酸特性进行了基本分析,结果显示AVNV是单链不分节段的RNA病毒。采用随机引物和Oligo(dT)双引物法,用SuperScript Ⅱ反转录酶合成cDNA,并克隆到pUC118质粒上,构建了AVNV核酸的部分cDNA文库,通过蓝白斑显色、PCR反应和酶切分析相结合筛选阳性重组子,测定了重组cDNA克隆的部分序列并进行了序列分析,最终从中筛选出23#、52#特异重组cDNA克隆。在23#、52#重组质粒基础上,设计2对特异性引物,预计目的产物分别为406bp和412bp,开展了AVNV的RT-PCR检测技术的研究,建立了一种快速、准确、灵敏的AVNV RT-PCR检测方法,本方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,以P23F、P23R为特异性引物的RT-PCR检测AVNV RNA的检出灵敏度为1pg,以P52F、P52R为特异性引物的RT-PCR检测AVNV RNA的检出灵敏度为100pg,与栉孔扇贝闭壳肌基因组DNA无交叉反应。利用非放射性标记物地高辛(DIG),分别以23#质粒DNA为模板,P23F、P23R为引物和以52#质粒DNA为模板,P52F、P52R为引物通过PCR法制备了23#、52#AVNV的cDNA探针,探针长度分别为406bp和412bp,标记产量分别约为60ng/μL和40ng/μL。通过核酸探针斑点杂交检测法对探针特异性和灵敏度进行验证,结果表明,23#、52#探针都具有较高的灵敏度和较强的特异性,分别检测AVNV RNA的检出灵敏度为6.1pg和610pg,与栉孔扇贝闭壳肌基因组DNA无交叉反应。利用该法检测栉孔扇贝样品,结果显示栉孔扇贝的外套、鳃、肾、消化腺都显示阳性杂交信号,生殖腺、闭壳肌未显示杂交信号。本研究所建立的AVNV的RT-PCR检测方法和PCR法制备DIG标记探针的斑点杂交检测方法是2种快速、灵敏和特异的检测AVNV的方法,发展和完善这2种技术对栉孔扇贝急性病毒性坏死症的早期诊断和防治及抗病育种具有重要意义。……   
[关键词]:栉孔扇贝;急性病毒性坏死症病毒;cDNA文库;克隆;逆转录聚合酶链反应;斑点杂交
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国海洋大学2004年