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淋巴囊肿病毒的检测及其对牙鲆鳃细胞系的感染研究

曾晓华

  淋巴囊肿病是一种发生在全世界范围的常见的鱼类皮肤病,由淋巴囊肿病毒引起。患病鱼体表长满皮肤瘤状和菜花状的赘生物,面目可憎,丧失市场价值,造成极大的经济损失。分离培养淋巴囊肿病毒,筛选中和抗体,对研制淋巴囊肿病疫苗,预防该病的发生极为重要。由于淋巴囊肿病为慢性病,活体攻毒实验耗时长且不易成功,因此,病毒在细胞中的培养是该项研究的基础和关键所在。本文运用多种方法,证实牙鲆鳃细胞系为淋巴囊肿病毒的敏感细胞系,并对淋巴囊肿病毒感染鳃细胞的最适条件和时间动力学等因素作了较为系统的观察。本文通过改变培养牙鲆鳃细胞的气体、血清浓度、接种密度等条件,系统研究了鳃细胞在20℃(淋巴囊肿病发病温度)的最适生长条件。实验结果表明,牙鲆鳃细胞的最适接种密度为3-4×10~5cells/ml,开放式培养时最适CO_2浓度为2%,含2%血清的培养液能较好的维持细胞生存而不大量增殖,含10%血清的培养液能使细胞正常生长增殖,含20%血清的培养液能使细胞迅速增多,并能使细胞密度维持很高的水平。本文采用不连续密度梯度离心的方法分离提纯淋巴囊肿病毒作为抗原,运用单克隆抗体技术,筛选、克隆出2株产生抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞(1A6、1H9)。经免疫荧光抗体法检测,2株单抗与淋巴囊肿细胞包涵体呈阳性反应,可作为检测病毒的有利工具。以病毒粗提液感染鳃细胞,1-2天出现明显细胞病变,TCID_(50)为40μl 2~(2.57)稀释的病毒液。以出现细胞病变培养孔的上清液接种正常鳃细胞,细胞不出现病变;以出现细胞病变培养孔的上清及细胞混合液接种正常鳃细胞,细胞出现病变。以抗病毒单抗为第一抗体,运用免疫细胞化学、免疫荧光抗体技术,在接种病毒的鳃细胞中检出阳性,24小时之内,病毒在细胞中开始复制,48-72小时达到顶峰。运用斑点免疫吸附法,在细胞培养上清液中未检出病毒。……   
[关键词]:牙鲆;鳃细胞;淋巴囊肿病毒;单克隆抗体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国海洋大学2004年