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角膜内皮细胞体外培养的研究

贺君

  角膜内皮细胞形态学上的完整和功能上的健全是临床上评价角膜功能的指标,也是角膜保存质量评定的标准。观察药物及一些因素对角膜内皮细胞活性的影响离不开角膜内皮细胞的体外试验,而体外试验的成功也依赖于良好的角膜内皮细胞培养。角膜内皮盲是角膜病的一种常见病,角膜内皮细胞的体外培养对于角膜生物学、病理学、药理学以及角膜移植的研究具有重要的意义,也是体外构建组织工程化人工角膜的重要研究内容之一。本论文通过对角膜内皮细胞体外原代培养和传代培养的方法进行筛选和优化,确定角膜内皮细胞原代培养的方法;揭膜培养法:角膜缘内1mm揭取角膜内皮细胞层,贴于瓶底,使其贴壁生长,可以获得六角形单层内皮细胞。不使用Trypsin,避免酶对内皮细胞的损伤。不需较多材料。消化培养法:材料较多时,采用消化培养法,培养中需控制Trypsin的消化时间和浓度;接种细胞易贴壁。组织块培养法:角膜材料较少,采用组织贴片培养法,方法简便易行,细胞迁出和生长速度较快,避免了Trypsin对细胞的损伤,细胞生长形态正常。通过研究,确定了角膜内皮细胞最适培养液为DMEM/F12(1:1)。实验结果表明其生长效果较好。角膜内皮细胞传代培养方法:从酶的浓度、酶的用量、酶作用的时间、洗涤离心等方面进行了研究,得到了适合角膜内皮细胞的传代方法。首次进行了促进角膜内皮细胞生长的海洋生物提取物的筛选研究,以解决内皮细胞生长缓慢,传代困难的问题;实验结果表明,筛选的各海洋生物提取物对角膜内皮细胞生长均有一定的促进作用;其中以壳寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖促进角膜内皮细胞生长效果显著(p<0.0005),对角膜内皮细胞的促进生长作用呈量效关系,与EGF作用相当。与EGF相比,成本低廉,有望在角膜内皮细胞的体外培养和组织培养中得到应用。角膜内皮细胞在多糖生物膜材料上培养实验结果表明:角膜内皮细胞在6315多糖生物膜上贴附和生长情况良好,表明内皮细胞与6315多糖生物膜有良好的生物相容性。在角膜内皮细胞贴附载体膜培养过程中,配合使用壳寡糖、N-乙酞氨基葡萄糖和细胞生长因子EGF均可以促进角膜内皮细胞在膜上的生长,形成人工活性内皮细胞载体膜所需时间大大缩短,为人工活性角膜的构建提供了一定的基础。角膜内皮细胞冷冻保存实验结果表明:甘油作为角膜内皮细胞的保护液进行深冷冻保存的效果较好,在15%的甘油保护液中保存,细胞复苏成活率较高,细胞形态正常。在细胞的保存过程中,以15cm/hr的冷平衡时间较好,细胞成活率较高,细胞形态正常。复温方法实验结果表明:60℃和40℃水浴复温均可获得较高的细胞成活率,但前者容易导致角膜内皮细胞的损伤。……   
[关键词]:角膜内皮细胞;培养;海洋生物提取物;多糖生物膜;细胞保存
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2004年