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我国养殖大菱鲆病毒性红体病的研究

史成银

  大菱鲆(Scophthalmus maximus)属名贵海水经济鱼类,原产于欧洲沿海。自1992年引入我国并于1998年开展大规模养殖以来,大菱鲆已成为我国北方沿海地区最重要的工厂化海水养殖鱼类之一,年产值达15亿元以上。但近年来我国养殖大菱鲆疾病流行日益严重,已严重威胁着该养殖产业的健康发展。由于大菱鲆是从国外新引进的养殖品种,我国在其疾病研究方面基本上还是空白。通过大量的疾病调查,本研究发现了一种可导致我国养殖大菱鲆大量死亡的流行性疾病。依照病鱼的外观症状,将该病暂称之为大菱鲆“红体病”(reddish body syndrome,RBS)。通过对RBS的流行病学、组织和细胞病理学、病原人工感染和细胞接种实验、病毒的纯化和分子生物学分类鉴定等研究,本论文在国内外首次证实大菱鲆红体病是由一种新的鱼类虹彩病毒——“大菱鲆红体病虹彩病毒”(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)——引起的病毒性疾病,应称之为“大菱鲆病毒性红体病”(viraI reddish body syndrome of turbot)。大菱鲆病毒性红体病的流行病学调查显示:苗期、养成期、亲鱼期的大菱鲆均可感染此病,但以养成期最为常见;发病鱼全长一般在10厘米到20厘米,体重介于100克至400克之间。病鱼摄食量低或不摄食、活力弱、呼吸缓慢、散群,分散伏于养殖池四周或在水面附近缓慢游动。病鱼在出现以上症状后很快死亡,属急性死亡,一个月内的累积死亡率达20%以上。该病在养殖期的各个月份均可以发生,高发季节为每年的8月至12月,在5月至7月则相对较少。至2003年,该病的流行范围已遍布整个山东半岛沿海地区,涵盖了我国大菱鲆的主产区。病毒性红体病大菱鲆的解剖学特征主要有:(1)病鱼体表无明显损伤,但腹面沿脊椎骨附近皮下淤血、发红,侧鳍、尾鳍、胸鳍及鳍基部充血、发红;(2)病鱼贫血,鳃外观呈暗灰色;(3)病鱼血液稀薄、色淡,凝固性差;(4)病鱼胃肠壁呈点状出血;(5)病鱼肾脏失血发暗,呈灰白色。大菱醉病毒性红体病的组织病理学研究发现,病鱼的脾脏、’肾脏存在有大量的肥大细胞,病鱼鳃丝、脾脏、肠、’肾脏和肝脏组织均存在不同程度的坏死。通过透射电子显微镜观察,在病鱼的多种组织包括鳃、脾脏、肠、肾脏中可以观察到一种大小相同、形态相似的球状病毒粒子,即丁RBIV。这是感染我国养殖大菱坪的下R曰V首次被发现。该病毒的特征包括:(1)成熟病毒粒子具二十面体状的蛋白衣壳(其横切面为六边形或五边形)和球状的病毒核心,病毒含有典型的内脂质膜样(internal,iPid membrane一Iike)结构;(2)成熟病毒粒子的二十面体状衣壳和球状核心的大小分别为,25nm和67 nm左右;(3)病毒在宿主细胞质中装配并以出芽的方式释放;(4)病毒靶组织为鱼体的脾、肾、鳃、肠中的上皮和结缔组织,被病毒感染的细胞多表现为细胞肿大,细胞质匀质化。这些研究明确了大菱坪病毒性红体病的病理学特征,为该病的病理学诊断提供了依据。为了证实丁RBIV是大菱娜病毒性红体病的病原,本研究进行了大菱虾病毒性红体病的人工感染试验。将过滤除菌的含大量下RBIV的病鱼脾组织匀浆液,通过腹腔注射的方式对健康大菱鲜进行人工感染,结果感染鱼在3周内的累积死亡率达85.7%,死亡大菱鲜表现出腹面和鳍边发红等外观症状。由此证明丁RBIV具有较强的致病力。为了进一步验证下R曰V的致病性和病原性,本研究还开展了牙虾胚胎细胞系(flounder embryonie eell .ine,FEC)培养细胞接种TRBIV的试验。结果表明,过滤除菌的含大量TR曰V的病鱼脾组织匀浆液可以使FEC单层培养细胞产生明显的细胞病变(cytopathic effects,CPE),在病变「EC培养细胞的细胞质中可以观察到大量的TRBIV。以上实验结果证实TRBIV具有较强的致病性和病原性。通过差速和超速离心,从病毒性红体病大菱虾脾、肾组织内纯化出一种直径约为115~125 nm的球状病毒。该病毒在形态和大小方面都与在病鱼组织超薄切片中发现的TRBIV相似,也与接种TRBIV的FEC培养细胞中观察到的病毒相似。以上这些研究结果证明,丁R曰V是我国养殖大菱虾病毒性红体病的病原。依据TRBIV的形状、大小、在感染细胞内的位置以及靶组织类型等判断,该病毒不同于已报道的大菱醉虹彩病毒,是一种新的感染我国大菱虾的虹彩病毒。为了深入了解丁RBIV的特性、分类地位,开展了TRBIV的分子生物学鉴定研究。使用依据真绸虹彩病毒(red sea bream iridovirus,RS!均主要衣壳蛋白(major capsid protejn,MCp)基因保守区设计的一对peR引物,成功地从病毒性红体病大菱坪脾组织中扩增出了病毒特异性片断,对该片断进行的克隆和序列测定表明,该片断长度为620 bp,编码病毒MCP的C末端205个氨基酸。该序列己被登录到GenBank数据库中,检索号为八丫590687。将TRB!V MCPC末端的205个氨基酸序列与GenBank中20种虹彩病毒MCP的C末端相应序列进行多序列排列和比对,发现下RBIV和RSIV、鳗鱼传染性脾肾坏死病毒(infectious sPleen and kidney neerosjs vjrus,ISKN均的同源性最高(达98%),而与蛙虹彩病毒(f rog Virus3,「V3)、淋巴囊肿病毒(LymphoCystiS……   
[关键词]:大菱鲆;病毒病;大菱鲆红体病虹彩病毒;病理学;虹彩病毒;检测技术
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2004年