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柔嫩艾美尔球虫耐药株的蛋白质研究

刘文江

  用中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所球虫组诱导并保存的两个柔嫩艾美尔球虫耐药株(马度拉霉素耐药株和地克珠利耐药株)及其同母源敏感株感染2周龄无球虫罗曼小公鸡,用PBS液分别收取三个虫株第二代裂殖子、未孢子化卵囊、孢子化卵囊,纯化后-70℃保存。 1、加PBS反复冻融5次(-70℃10min,35℃水浴5min),冰浴条件下150W间断超声30min,12000r/min离心1h,蛋白质含量测定后进行SDS-PAGE,凝胶经考马斯亮蓝染色,利用Imagemaster VDS软件系统对结果进行分析。结果显示,地克珠利耐药株孢子化卵囊有三条超表达的蛋白质条带,其分子量和相对含量分别为:42.0ku、2.1%, 26.5ku、45.8%,25.5ku、23.8%;马杜拉霉素耐药株孢子化卵囊有一条超表达蛋白质条带,其分子量为26.5ku,相对含量为23.0%;耐药株其余各阶段的蛋白质相对含量和蛋白质条带与敏感株没有明显差异;2、敏感株与耐药株第二代裂殖子蛋白质采用银染后经Imagemaster VDS软件分析未发现有条带差异;3、以40mmolTris(pH9.5),冰浴,150W间断超声破碎提取第二代裂殖子蛋白质,Brondford法定量,蛋白质上样量80μg, pH3-10L 13cmIPG干胶条(Amersham Parmacia Biotech)用IPGphor等电聚焦仪进行等电聚焦,设定总聚焦65560vh ,平衡后转移至DALTsix电泳系统以0.5mm12.5%均匀胶进行垂直电泳SDS-PAGE, 凝胶银染,用Amersham Parmacia Biotech 的2D-Elie软件进行分析。结果显示:与敏感株相比各耐药株均有四个表达差异点,其分子量和等电点为地克珠利耐药株(Mr/pI):32.7ku/6.3、31ku/7.35、29.2ku/6.85、27.3ku/5.7,马杜霉素耐药株(Mr/pI):33.5ku/5.9、29.2ku/6.85、26.7ku/5.6、26.7ku/5.6。这些差异斑点蛋白质均为一些小分子蛋白质,可能参与了球虫耐药性的发生、发展。对这些差异点进行进一步的分析(如质谱分析),结合对虫体不同阶段蛋白质及膜蛋白质等的分析并进行生物信息学分析,将有助于球虫耐药性快速诊断方法的建立,同时也为揭示球虫耐药性产生的机理初步奠定了基础。……   
[关键词]:柔嫩艾美尔球虫;耐药性;蛋白质;蛋白质组;双向电泳
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2004年