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灰葡萄孢生物活性代谢产物的研究

王惠

   灰葡萄孢是一种分布广、致病性强的植物病原真菌。对其致病性的研究较多,但涉及应用的报道甚少。从开发利用真菌资源,创制环境和谐农药的目的出发,本研究选灰葡萄孢为目标真菌,在筛选菌株及其培养条件的基础上,测定了高活性菌株代谢产物的农药活性和安全性,进而对活性成分进行分离和结构鉴定。1. 从 11 种菌株中筛选出 BC4 菌株为高活性菌株,反枝苋为其敏感植物。同时确定了在 pH 3-4 的改良-Fries 培养基中,在 25℃黑暗条件下静止培养 15-35d 得到的培养滤液活性最高。 2. 分别用生长速率法和抑菌圈法测定培养滤液对部分植物病原真菌和细菌的抑菌活性,用浸渍法测定其杀虫活性,以杂草种子萌发和幼苗生长受阻为指标测定其除草活性。结果表明稀释 3 倍的灰葡萄孢培养滤液对小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌的抑制率分别为 66.2%、61.6%和 56.4%;对黄瓜角斑病菌、马铃薯环腐病菌和白菜软腐烂病菌的抑菌圈直径分别为 1mm、6 mm 和 9mm;稀释 20 倍的培养滤液对杂草种子发芽有明显抑制作用;在出苗 3d 后的供试植物叶面上喷施原液,24h 对反枝苋和牵牛花等双子叶杂草幼苗毒杀活性达 100%,而对禾本科的作物影响很小;培养滤液对黏虫、小菜蛾和菜青虫的杀伤活性很小。表明灰葡萄孢培养滤液中含有除草和抑菌活性成分。 3. 以种子根芽生长抑制率为指标,测定培养滤液对小麦和玉米种子发芽的安全性;以叶面喷施后测定幼苗高度抑制率的方法,探讨培养滤液对作物幼苗生长的安全性;以收获时作物的株高,穗粒数、千粒重及穗重等为指标,测定培养滤液对小麦和玉米产量的影响。结果发现,稀释 20 倍的培养滤液对小麦、玉米种子萌发均有抑制作用,但对幼苗生长几乎无影响;将培养滤液浓缩 12 倍,在小麦和玉米一芯一叶期叶面喷施,收获前小麦和玉米的结穗大小和籽粒饱满程度与对照没有明显差异。表明灰葡萄孢发酵液可以作为小麦和玉米的苗后除草剂或杀菌剂开发利用。 4. 以反枝苋等植物作为活性跟踪的指示植物,用薄层层析法、柱层析和 HPLC 法等方法,从培养滤液中分离到 4 个农药活性化合物。其中 3 个化合物对植物种子萌发具有控制活性;另一个对反枝苋种子和幼苗具有毒杀活性。通过荧光扫描分析,发现分离到的杀草活性物质在 312nm 波长激发光的作用下可以发出 415nm 的荧光。推测这一化合物为一个尚未报道过的除草活性成分。 5. 用紫外、红外、核磁共振和质谱等方法鉴定了 3 种对植物种子萌发具有控制作用的化合物的结构。它们分别为脱落酸、脱落酸-β-D-葡萄糖酯和脱落酸-β-D-葡萄糖苷。后 2 个化合物是首次从真菌灰葡萄孢发酵液中分离得到的化合物。 6. 通过对 2 种化合物(脱落酸-β-D-葡萄糖酯和脱落酸-β-D-葡萄糖苷)的水解和光照试验,发现脱落酸-β-D-葡萄糖酯在酸性甲醇水中可以发生水解;脱落酸-β-D-葡萄糖苷在光照条件下可以发生结构转化。结合实验中这 2 个化合物难以纯化的现象,提出了脱落酸在灰葡萄孢代谢产物中存在的原始形式是脱落酸葡萄糖苷的新假设,并推测光照后脱落酸-β-D-葡萄糖苷发生结构转化形成脱落酸-β-D-葡萄糖酯,后者进一步水解产生脱落酸及其非活性异构体。由酯水解的可逆反应特性,推测灰葡萄孢代谢产物在光照后的体系是一个由脱落酸-β-D-葡萄糖苷、脱落酸-β-D-葡萄糖酯、脱落酸及其非活性异构体等成分组成的平衡体系。 7. 对培养滤液进行光照实验的结果表明,随着光照时间的延长,滤液的活性明显下降,光照 24h 后滤液活性已降低 50%,36h 后仍有活性,但活性不再下降。滤液的颜色变化比活性变化的速度高,在光照 1h 后已基本稳定。由此推测,光照 1h 内主要是部分有色的脱落酸-β-D-葡萄糖苷发生结构转化,1h-24h 间主要是无色的酯和无色的葡萄糖、脱落酸以及脱落酸的非活性异构体的转化和平衡。 8. 浓缩实验的结果表明,采用旋转浓缩方法浓缩灰葡萄孢培养滤液对滤液活性的影响不大。 ……   
[关键词]:灰葡萄孢;活性成分;抑菌活性;除草活性;培养条件
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2004年