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基因芯片检测新城疫病毒和PCR结合内切酶分析鉴别新城疫强弱毒株的研究

耿捷

  新城疫(New Castle Disease,ND)是新城疫病毒引起的一种急性、高度接触性禽类传染病,被世界动物卫生组织(OIE)定为A类传染病。新城疫病毒(NDV)是副黏病毒科、副黏病毒亚科、腮腺炎病毒属的成员,为有囊膜的负链RNA病毒,可存在于病禽的所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。目前国内对于新城疫的诊断,主要是采用传统的病原分离鉴定及血凝抑制试验(HI)等血清学试验,与西欧、美国和日本等一些国家所采用的分子生物学诊断方法相比,技术上有较大的差距。我国加入WTO后,禽类产品国际贸易进一步增加,但传染病病原检测技术上的差距在禽类产品检验检疫中表现得更为突出,使我国禽类产品贸易在国际竞争中处于劣势。为改变这一不利局面,研究先进的传染病病原检测方法已成为当务之急。OIE推荐的诊断新城疫的方法有病毒分离鉴定,HI,鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)等致病指数试验,这些试验不但需要较长的时间,而且有散毒的隐患。目前我国出入境检疫中对新城疫病毒的检测方法主要有泻殖腔棉拭子样品病毒分离鉴定、HI和ELISA,RT-PCR检测技术正在试用之中。国外一些学者利用RT-PCR和nested-PCR结合序列分析等分子生物学技术对NDV进行了检测研究,这些技术具有快速、准确、无散毒性等特点,已被OIE推荐为评估NDV毒力的试验方法,西欧少数国家和日本在禽类产品国际贸易中已经开始采用这些方法进行NDV检疫,这些都为NDV检测技术的发展奠定了基础。基因芯片技术近年来在分子生物学研究和疫病检测方面发挥着越来越大的作用。利用基因芯片可加速对病毒基因组的功能分析;可建立遗传病的突变检测技术,并成为对多种遗传病的常规诊断技术;可用来监测宿主细胞基因表达的改变,研究病毒的致病机理;基因芯片还可用来对细菌基因的分型和菌种鉴定,为筛选和监测细菌的抗药性基因提供基础数据。目前我国在出入境检验检疫中,已开始在基因芯片技术检测传染病病原方面开展了研究工作,国家质检总局动植物检疫所研制出了检测SARS病毒的全基因芯片,极大的促进了出入境检验检疫检测技术的发展,但目前国内外尚未见到有关新城疫病毒基因芯片的报道。本文开展了基因芯片技术检测新城疫病毒和RT-PCR结合内切酶技术鉴别新城疫强弱毒株的研究,为我国对新城疫的快速准确诊断奠定了技术基础。1.应用基因芯片技术检测新城疫病毒在本试验中,我们依照寡核苷酸探针设计原则,设计出了30条20 mer寡核苷酸阵列,以期能平行、特异的检测NDV。通过对6株病毒的检测结果显示,在探针位点上,6个样品均检测到了阳性的荧光信号,而阴性及空白对照没有检测到信号,说明本芯片具有较好的稳定性和灵敏性。通过特异性试验检测禽流感病毒(AIV)H5、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的结果也表明,芯片杂交信号正确,具有良好的特异性。由于该芯片敏感性强、准确性高、特异性强、重现性好,且操作简单,成本较低,为新城疫病原的检测提供了一种新的有效手段,完全适用于新城疫病原的大规模筛检和快速检测,对出入境动物检验检疫具有重大意义。2.应用RT-PCR结合内切酶技术鉴别新城疫强弱毒株本试验扩增的序列为新城疫病毒F-糖蛋白基因的4893~5031序列,在其弱毒株序列中有BglⅠ内切酶的酶切位点,而此位点是强毒株序列所没有的。根据这一特性,用RT-PCR方法结合内切酶分析来鉴别45株NDV分离株的毒力,此结果与OIE标准中MDT毒力测定结果基本一致。在45株NDV分离株中,41株酶切结果只有202bp片段,为强毒株,与MDT结果相同。其余有4株(序号为8,9,10,44)的MDT在60h以上,其酶切结果表明2株(10,44)只有135bp和67bp,为弱毒株,2株(序号为8,9)除135bp和67bp,还有202bp片段,表明这2个毒株含有强弱毒双重序列,怀疑可能是受到强毒污染所致;弱毒株对照LaSota株的酶切结果清楚显示只有弱毒株序列。国内2株疫苗株的分析结果为弱毒序列。说明此方法可区分强毒株、弱毒株及疫苗株。应用RT-PCR对国内的45株分离株进行PCR扩增,其结果进一步证实了分离NDV的其他血清学结果(HA,HI等)。结合内切酶分析,能更进一步确定分离株毒力的强弱。传统的MDT,ICPI和IVPI等强弱毒鉴定方法过程繁琐,操作费时、费力,从接种到结果判定需7~10d的时间,并且在操作过程中有引起交叉污染和散毒的可能性。本试验采用RT-PCR结合内切酶分析,有效的避免了这些方法的不足,并且操作简便、快速,可在24~36h内确定分离株的毒力,也减少了散毒和分离样品在处理过程发生交叉污染的可能性。该方法不仅能鉴别样品中新城疫病毒的强弱,还可诊断APMV-1引起的其他禽类的感染,如本研究中诊断企鹅,鸽子和鸵鸟的感染等,因此,对促进出入境动物检验检疫技术的发展,打破发达国家的技术壁垒具有重大意义。……   
[关键词]:新城疫病毒;基因芯片;检测;RT-PCR;内切酶;鉴别;强弱毒株
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2004年