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基因工程药物人干扰素-γ体外重折叠复性研究

靳挺

  通过外源基因在E. coli中的表达来获得蛋白质类药物,已经成为生产基因工程药物的重要手段,然而重组蛋白质在E. coli中易聚集形成不溶性、无活性的包涵体,如何对包涵体蛋白进行高浓度、高收率的复性,是重组蛋白质生产的关键性技术之一,且关系到基因工程药物的产业化。为此,本文对重组人干扰素-γ包涵体的重折叠复性进行了研究,以有助于这一问题的解决。首先对重组人干扰素-γ基因工程菌(pBV220IFN-γDH5α)的培养条件进行了研究,通过考察不同的培养和诱导时间,并对培养基的组成和发酵条件进行了优化,得出了优选实验方案:人干扰素-γ基因工程菌在30℃培养8h,升温至42℃诱导6h,培养基组成为葡萄糖2g/L,胰蛋白胨15g/L,酵母提取物7.5g/L,NaCl 5g/L,Na_2HPO_4·12H_2O 12.6g/L,KH_2PO_4 3g/L,NH_4Cl 1.0g/L,1mol/L MgSO4 2mL/L,发酵条件为摇床转速:220r/min,接种量:1%,装液量:20%,pH:6.8。按此方案进行发酵实验,表达的人干扰素-γ包涵体占菌体总蛋白的60%以上,每升发酵液可获得1.6g包涵体。稀释复性法是研究其它复性方法的基础。为消除杂质对复性的影响,在复性前,应对包涵体粗品进行洗涤。Triton X-100能有效地溶解杂蛋白,洗涤后的包涵体纯度可达88%左右。7mol/L盐酸胍和8mol/L尿素能有效溶解重组人干扰素-γ,包涵体。在4℃、pH 8.0、尿素浓度1.0mol/L、蛋白浓度0.1mg/mL及脉冲加样操作方式等条件下,复性后人干扰素-γ的活性为2.39×10~5IU/mL,比活达2.21×10~7IU/mg。以SP Sepharose Fast Flow尿素梯度离子交换层析柱作为蛋白质复性系统,在高蛋白浓度下,能有效地复性重组人干扰素-γ,包涵体,并实现了复性和纯化的过程集成化。在上样量:2.5mg;流速:0.5mL/min;尿素梯度长度:3.4Column Volume;尿素终浓度:2mol/L的实验条件下,复性后人干扰素-γ的比活为7.5×10~5IU/mg,蛋白收率为:54%,纯度>95%。利用Superdex 75凝胶柱,分析离子交换层析复性的样品,证实重组人干扰素-γ的纯度很高,并且没有聚集体存在。扩张床的处理量大,通过逐渐降低层析柱内的尿素浓度,使吸附在STREAMLINE SP凝胶上的蛋白质复性,在完成复性的同时又纯化了目标蛋白,实现了复性和纯化的集成化。在上样量:23.2mg;膨胀率:2.5;尿素梯度长度:6CV;尿素终浓度:3mol/L的实验条件下,复性后人干扰素-γ的比活为8.18×10~6IU/mg,蛋白收率为:52.7%,纯度>90%。浙江大学博士学位论文摘要小分子伴侣Shi GroEL191一345在E.。011中表达、经3.7L罐发酵,再经过Ni一NTA亲和层析和脱盐两步纯化步骤,最终收获目标蛋白为216.2m留L发酵液,小分子伴侣Sht GroELI 91一345的总收率约80%,纯度大于95%。游离和固定化小分子伴侣sht GroEL191一345小分子伴侣能有效地协助rhIFN一丫包涵体的复性,在蛋白浓度100抖g/mL、巧℃、复性4h的条件下,复性后人干扰素一Y的总活性分别为6.63xl护Iu/mL和9.67x10s Iu/mL,蛋白收率分别为:32.5%和47.5%。经荧光光谱测定,重折叠人干扰素一了的构象接近于天然构象,表明复性较为完全。……