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中国对虾免疫相关分子抗菌肽和热休克蛋白的研究

郭振宇

  本文利用免疫学、生物化学、细胞生物学、分子生物学等手段,通过对抗菌肽和热休克蛋白这两种与抗病及抗逆密切相关的免疫分子的研究,初步揭示了中国对虾免疫学的某些特征和机理。经过大量实验,成功摸索出一套免疫诱导方法,并通过人工注射鳗弧菌Vibrio anguillarum对中国对虾进行免疫诱导。建立并应用毛细管区带差异显示电泳技术,用弹性石英聚丙烯酰胺涂渍毛细管柱对中国对虾免疫诱导前后其血淋巴多肽表达差异进行了分析,实验结果表明:鳗弧菌人工感染3小时后,中国对虾血淋巴多肽增加,6小时达到最高值,24小时后,其多肽表达水平逐渐恢复正常。在毛细管电泳基础上,选择鳗弧菌感染后6小时的中国对虾血淋巴,通过酸抽提和C18柱固相抽提预纯化及HPLC纯化,首次从中国对虾血淋巴中分离纯化得到抗菌肽分子,通过抑菌实验表明,该抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现抗性。纯化产物经Edman降解法测序得到其N-端15个氨基酸序列:QRGGYTPPGIRPPYG-,将此序列在SWISS-PROT蛋白质数据库中进行比对,发现与凡纳对虾抗菌肽N-端序列具有61%的同源性。通过荧光显微镜对中国对虾免疫诱导前后的血细胞类型及其数量变化进行了观察和统计,实验结果表明:中国对虾血细胞分为三种类型,即无颗粒细胞(Agranular hemocyte)、小颗粒细胞(Small-granule hemocyte)和大颗粒细胞(Large-granule hemocyte);鳗弧菌免疫诱导后,每毫升对虾血细胞总数在感染后6小时明显减少,24小时后逐渐恢复;无颗粒细胞所占比例感染后显著增加,6小时到达最高值,48小时恢复到正常水平;相反,小颗粒细胞和大颗粒细胞感染后比例则均明显减少,小颗粒细胞在24小时达到最低值,48小时恢复正常;大颗粒细胞在6小时达到最低值,24小时恢复正常。间接验证了甲壳动物抗菌肽的产生及来源部位为颗粒细胞。利用异硫氰酸胍抽提法分别提取中国对虾不同发育阶段(P11期仔虾——稚虾)的总RNA,通过半定量RT-PCR的方法对于中国对虾不同发育阶段的抗菌肽表达情况做了初步研究。证实甲壳动物抗菌肽基因为组成型,并且在中国对虾不同发育时期均有表达。 应用免疫印迹Western immunobloting的方法,对于中国对虾生存环境中的几种逆境因子(高温、低温以及细菌和病毒感染)条件下,其不同组织HSP70的表达进行了初步研究,实验结果显示高温和弧菌注射感染均可使对虾肝胰腺和鳃中HSP70表达量明显升高,并证实了热休克蛋白与甲壳动物耐热性及抗病力的获得具有密切相关性。这是关于中国对虾热休克蛋白的首次报道。……   
[关键词]:中国对虾;抗菌肽;毛细管电泳;HPLC;血细胞;RT-PCR;免疫印迹;热休克蛋白
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国科学院研究生院(海洋研究所)2004年