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鸭肝炎病毒单克隆抗体的制备及初步应用

杨萍萍

  鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的一种主要发生于3周龄以下雏鸭的传播迅速、高度致死性的传染病。本课题对鸭肝炎病毒在鸡鸭胚、鸡胚成纤维细胞和鸡胚肝细胞上的生长繁殖进行了研究,制备了纯度较高的DHV抗原,以此免疫BALB/c小鼠并建立了间接ELISA筛选方法。经过一系列的融合筛选,成功研制了抗Ⅰ型DHV-YZ株单克隆抗体4株,并在检测DHV抗原、抗体方面进行了初步应用。本试验中对3株Ⅰ型DHV在三种不同宿主系统中的增殖进行了比较。用鸡胚和鸭胚进行3株DHV的增殖时,均可导致胚体出血、水肿、肝脏出血、边缘坏死以及花斑肝等典型鸭肝炎症状。接种后死亡时间以DHV-YZ株最快,DHV-ZJS株最慢,ELD50/0.2ml分别为104.68、104.25、103.28。采用鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肝细胞(CELC)对三株Ⅰ型DHV进行细胞培养,结果表明三株DHV均能适应CELC培养,而DHV-YZ株不能适应CEF培养。经数代盲传后,在CEF上两株DHV表现基本相同,在48h时CPE开始出现;而在CELC上表现更为敏感,三株DHV在24h内即出现病变。两种细胞病变相似,均表现为细胞圆缩,间隙拉宽,死亡脱落等,测得DHV-ZJS和DHV-NJ在CEF上的TCID50分别为103.41和103.90,细胞适应能力DHV-ZJS>DHV-NJ>DHV-YZ。各个宿主增殖病毒回归1日龄雏鸭均导致典型鸭肝炎症状。对鸡胚和鸭胚增殖的尿囊液病毒用反复冻融、氯仿处理、0.22μm滤膜过滤、PEG反透析浓缩以及Sephadex G-200分子筛层析的方法进行纯化,并以此来包被酶标板以及进行BALB/c小鼠免疫,效果良好。经反复试验,本研究确定了间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件,即:抗原包被浓度为0.5μg/孔,以1:6400稀释的阴、阳性血清分别作为阴、阳性对照,反应条件均以37℃ 60min为佳。在此工作条件下,测定82份阴性杂交瘤细胞上清的OD值,根据①P/N≥2.1和②P≥N+3sd两个标准确定阳性杂交瘤细胞判定临界值为0.193。以建立的该方法对融合后杂交瘤细胞进行检测筛选,经过初检、二检,共获得阳性杂交瘤细胞株12株。利用有限稀释法进行3次亚克隆后,最终获得单抗4株,分别命名为2B5、2E8、5E6和6C11。对这4株单抗的效价和特异性测定结果表明,其ELISA效价以2B5和2E8最高,可达1:102,400,5E6最低,为1:6400,平均腹水中抗体效价要比细胞上清中高200~500倍,4株单抗特异性好,但中和特性较差。本研究中对辛酸-硫酸铵法和硫酸铵法提取鸭血清中IgG进行了比较,经蛋白含量测定和SDS-PAGE电泳分析表明,虽然硫酸铵法提取蛋白含量要比辛酸-硫酸铵法高,但辛酸-硫酸铵法提取IgG的纯度和活性都明显高于硫酸铵法。试验中用提纯的IgG包被酶标板,建立了检测DHV的单抗AC-ELISA,确定IgG的最佳包被浓度为1:80,单抗的最佳稀释度为1:100(效价1:102,400),经比较表明该IgG包被法要优于单抗包被。另外,还建立了检测DHV的单抗Dot-ELISA,确定最佳点样量为2.723μg/dot,最小检出量为1.362μg/dot,单抗最佳稀释度为1:400(效价1:102,400)。两种方法均能特异地从病料中检出DHV,对接毒后的死亡胚各部分检测结果表明,胚肝中病毒含量最高,而尿囊液中最低。对25份人工发病病料、10份可疑DVH病料和10份可疑DHV分离物的检测符合率为97.7%,表明所建立的单抗AC-ELISA和单抗Dot-ELISA应用效果良好,操作简单、方便,结果特异性强,敏感性高,比较适用于疾病诊断中大批病毒样品的检测。……   
[关键词]:DHV;单克隆抗体;间接ELISA;AC-ELISA;Dot-ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2004年