手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

鸡恒定链基因的克隆、表达及其抗体制备

刘玉华

  恒定链(invariant chain,Ii)是一种非多态性Ⅱ型跨膜糖蛋白,主要存在于人、哺乳动物和禽类的体细胞表面,如B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、胸腺上皮细胞等。Ii链作为MHCⅡ类分子的伴侣蛋白,它主要有以下功能:(1)辅助MHCⅡ类分子在内质网中进行正确折叠并迁移出内质网;(2)提供MHCⅡ类分子进入内体/溶酶体的靶信号;(3)阻止MHCⅡ类分子与内质网的内源性抗原结合。因此,Ii链在MHCⅡ类分子呈递外源性抗原给CD4+ T淋巴细胞的过程中起着关键性作用,对于机体的免疫应答具有重要调节意义。研究表明有Ii基因参与的DNA疫苗可增强机体的免疫反应。本研究根据GenBank中登录的鸡Ii基因序列和载体pcDNA3的多克隆酶切位点设计一对引物,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从经过有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA)刺激16h活化的鸡脾淋巴细胞中扩增出大小约为672bp的基因;经单酶切鉴定,与已知的鸡Ii基因含有相同的PstⅠ酶切位点。将其克隆到载体pcDNA3中,并转化宿主菌DH5α,双酶切方法鉴定重组质粒pcDNA3-Ii。进一步测定重组质粒pcDNA3-Ii中鸡Ii基因的核苷酸序列,结果表明该基因完整开放阅读框架(Open reading frame , ORF)由672个核苷酸组成,编码223个氨基酸,与已知鸡Ii基因序列相比有98%的同源性,证明本实验成功的克隆到鸡Ii基因。根据所克隆的鸡Ii基因序列和原核表达载体PGEX-4T-1多克隆酶切位点设计另一对引物,应用PCR技术从重组质粒pcDNA3-Ii中扩增出含有完整ORF的鸡Ii基因。再将扩增的鸡Ii基因克隆到原核表达载体PGEX-4T-1中,构建原核表达重组质粒PGEX-4T-1-Ii,并进行双酶切鉴定。然后将该重组质粒转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于37℃诱导培养4h,表达出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与Ii的融合蛋白GST-Ii。通过优化原核表达条件,确定了原核表达的最佳诱导时间和诱导剂浓度。对表达蛋白的可溶性进行鉴定,结果表明表达产物GST-Ii融合蛋白以包涵体形式存在。我们用优化的原核表达条件对含有PGEX-4T-1-Ii质粒的BL21菌进行大量诱导表达,反复冻融和超声方法裂解诱导菌,获得浓度较高的GST-Ii包涵体蛋白,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,溶解的包涵体通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析获得纯化的GST-Ii融合蛋白。利用纯化的GST-Ii融合蛋白作为抗原分别免疫家兔和小鼠制备兔抗鸡Ii多克隆抗体和鼠抗鸡Ii多克隆抗体。琼脂扩散实验表明制备的两种多抗均具有良好的反应性,ELISA实验表明兔多抗和鼠多抗的有效稀释度分别可达1:25600和1:64000,免疫荧光抗体实验证实鼠抗鸡Ii多抗能与鸡外周血淋巴细胞中的Ii蛋白反应,表明该多抗的特异性较强。综上所述,本研究成功地克隆了鸡Ii基因,并进行了原核表达和纯化了表达产物Ii蛋白,制备了效价高、反应性和特异性强的兔源和鼠源抗鸡Ii多克隆抗体,这些为进一步研究鸡Ii免疫学功能及其应用提供了试验材料。……   
[关键词]:鸡Ii;克隆;原核表达;抗体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:安徽农业大学2004年