手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

AIV地方分离株(H9N2)HA和NA基因克隆、序列分析及HA的原核表达

唐志芬

  禽流感(Avian Influenza,AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的传染性疾病综合征。低致病力禽流感常引起呼吸道症状,产蛋量下降。1994年首次报道H9N2AIV在中国流行,并且已成为中国现有AIV的主要亚型。近几年发现,H9N2 AIV不仅感染禽类,还感染猪和人。因此,开展对禽流感病毒H9N2亚型的研究,从分子水平掌握AIV H9N2亚型的流行规律,不仅在病毒学、兽医学等学科上有重要的学术意义,而且在公共卫生等方面也具有重大的社会意义。本实验先将地方分离株A/Chicken/Mudanjiang/0823/00(H9N2)(MJ00)在SPF鸡胚中增殖,提取核酸,根据AIV 8个基因片段的3’末端高度保守的核苷酸序列特点,设计一条反转录引物,根据GenBank已发表的H9N2 AIV HA基因和NA基因cDNA序列,利用Oligo4.1和Primer5.0软件分别设计并合成HA基因和NA基因的特异性引物各一对,通过RT-PCR方法扩增出HA基因和NA基因,将HA、NA连接到pMD18-T载体上。序列测定及分析结果为,HA基因cDNA包含完整的开放阅读框架,全长为1716bp,共编码560个氨基酸,其中信号肽18个氨基酸,HA1 320个氨基酸,HA2 222个氨基酸。与GenBank上发表的24株同亚型毒株的核苷酸同源性在81.5%-99%之间,氨基酸同源性在 87.5%-97.9%之间。裂解位点附近的氨基酸序列为RSSR↓GLF,符合低致病力禽流感病毒的分子特征。因此,从分子水平证实,MJ00毒株为低致病力毒株。NA基因cDNA全长为1448bp,共编码469个氨基酸,与GenBank收录同亚型的24株毒株的核苷酸同源性在82.5%-98.9%之间,氨基酸同源性在 85.7%-98%之间,与香港和内地流感毒株相比,MJ00 NA的茎部没有3个氨基酸残基的缺失。将HA基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,将鉴定为阳性的重组质粒转化到感受态细胞BL21 (DE3) pLyS中,挑选含重组质粒pGEX-6P-HA的菌落,经IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导后,SDS-PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST大小为26ku)融合后大小约为88ku,目的蛋白分子量约为62ku,与理论值相符。本实验首次克隆并获得了中国地方分离株MJ00的HA和NA全基因序列,并对HA基因进行了原核表达,为制备基因工程疫苗、重组疫苗来预防禽流感提供了一定的理论基础。……   
[关键词]:禽流感病毒;HA基因;NA基因;克隆;原核表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北农业大学2004年