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AIV地方分离株(H9N2)NP和M1基因的克隆及表达载体的构建

管雪婷

  禽流感(Avian Influenza, AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的禽类感染和/或疾病综合征,该病首次于1878年在意大利报道,至今已遍布全世界。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染禽流感。禽流感病毒亚型众多,极易发生基因突变、重组和重排,具有高度的变异性,给禽流感的免疫和诊断带来了极大的困难。自1994年我国内地广东省首次分离到H9N2 AIV以来,H9N2 AIV在我国已广泛存在,制约了养禽业的发展。由于AIV的NP和M1结构高度保守,具有型特异性,均可作为AIV分类和诊断的基础,因此,从H9N2 AIV M1和NP基因作为切入点来研究禽流感的免疫和诊断不失为一个好的方法和途径。本实验用接种鸡胚的病毒增殖方法大量增殖禽流感地方分离株A/Chicken/Mudan jiang/0823/00(H9N2)(缩写为MJ00)。增殖病毒经差速离心进行纯化,经超速离心浓缩。根据AIV基因组特点设计1条通用引物T-1,反转录获取cDNA。根据Genbank发表的AIV NP、M1基因核苷酸序列,设计两对特异性引物NP-u/NP-l、M1-u/M1-l用以扩增核蛋白NP、基质蛋白M1基因。通过PCR技术,从病毒基因反转录产物cDNA中扩增出核蛋白NP、基质蛋白M1病毒完整基因片段,与pMD18-T克隆载体连接,构建重组质粒pMD18-T-NP、pMD18-T-M1。提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明,禽流感病毒分离株NP基因全长为1497bp,包含完整的ORF,编码498个氨基酸。M1基因 全长为759bp,包含完整的ORF,编码252个氨基酸。NP和M1基因测序结果已提交到Genbank,检索号为AY496851(NP)、AY496852 (M1)。与国内已发表的H9N2亚型禽分离株的NP和M1基因核苷酸序列和氨基酸同源性进行比较,结果表明,NP核苷酸同源性在90.51%-99.73%之间,推导氨基酸同源性在95.38%-99.40%之间;M1核苷酸同源性在90.78%-99.08%之间,推导氨基酸同源性在95.63%-100%之间,表明A型AIV的NP基因及M1基因的高度保守性。分离株MJ00与A/Chicken/GuangDong/11/97(H9N2)同源性最高,亲缘关系最近。其中,NP基因核苷酸同源性为99.73%,仅有4个核苷酸发生变异,氨基酸同源性为99.40%,仅有3个氨基酸发生变异。M1基因核苷酸同源性为99.08%,仅有7个核苷酸发生变异,氨基酸同源性为100%。系统进化树分析表明,分离株NP和M1基因均属于H9N2 AIV欧亚分支的Y280-like亚分支。将NP基因和M1基因分别插入pGEX-6p-1和PET-30a原核表达载体当中,构建了分别含有NP、M1基因的原核表达载体pGEX-6p-NP、PET-30a-NP、PET-30a-M1,为NP、M1基因的表达及进一步研究AIV NP与宿主特异性的关系、M1基因在病毒感染中的作用及禽流感的诊断和免疫奠定了一定的分子生物学基础。……   
[关键词]:禽流感病毒;NP基因;M1基因;克隆;原核表达载体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北农业大学2004年