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TNF-α对肾间质纤维化细胞表型变化的作用及补肾活血法中药对肾小管上皮细胞转分化的抑制作用

张勉之

  目的:肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)是各种肾病的终末期共同表现,与慢性肾功能衰竭密切相关,其主要病理变化是肾小管上皮细胞的减少,细胞外基质积聚,以及一定阶段内间质中出现较多的肌成纤维细胞(Myofibroblast,MyoF),肌成纤维细胞参与肾间质纤维化的形成过程。近来的研究认为间质中出现的MyoF除来源于成纤维细胞的活化外,部分来源于小管上皮细胞的转分化。小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞(tubular epithelial-myofibroblasttrans- diffentiation,TEMT)可能是进展性肾脏疾病发生间质纤维化的重要机制之一。马兜铃酸(aristolochic acid,AA)是马兜铃属植物的主要成分,可以直接损害肾小管上皮细胞,使其发生转分化、坏死或凋亡等,导致肾间质纤维化。最近有研究报告马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化可能是肾间质纤维化的主要原因。已有的研究发现转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和b成纤维细胞生长因子(b-fibroblast growth factor,bFGF)能单独诱导小管细胞的转分化,但其它细胞因子的作用尚不清楚,且TGF-β是TEMT最强有力的诱导剂,关于肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在肾小管上皮细胞转分化作用的研究尚未见报告。探讨TNF-α在TEMT的作用,对认识肾间质纤维化的机制很有帮助。目前,西药如黏附分子等防治RIF还处于实验阶段,尚未应用于临床。而中药抗RIF的研究尚处于起步阶段,仅对少数中药及其提取物有较深入的研究,而对中药复方的研究甚少,且缺少系统深入的作用机制研究。我们通过使用不同浓度的TNF-α刺激体外培养的肾小管上皮细胞,并与TGF-β联合作用,以观察TNF-α在肾小管上皮细胞转分化和肾间质纤维化进展中的作用,探讨TNF-α能否诱导人肾小管上皮细胞(human kidney cell,HKC)细胞发生表型变化;此外通过给予大鼠腹膜内注射纯品马兜铃酸,诱发肾间质纤维化,观察小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞在纤维化过程中的作用,以及TNF-α在转分化过程中的表达;通过单侧输尿管结扎术(Unilateral Ureteral Obstruction,UUO)造模,应用补肾活血法中药复方治疗肾间质纤维化,探讨该中药组方对肾间质纤维化的防治作用。方法:第一部分,选择HKC细胞为研究对象,分为4组:(1)阴性对照组;(2)TGF-β(8ng/ml)阳性对照组;(3)TNF-α各浓度组(1,5,50,100ng/ml);(4)TGF-β+ TNF-α联合用药组:TNF-α(50ng/ml)+ TGF-β(8ng/ml)、TNF-α(100ng/ml)+ TGF-β(8ng/ml)。应用形态学、间接免疫荧光法,免疫组化双染技术和酶联免疫吸附法观察各组HKC细胞发生表型变化和细胞外基质的形成情况。第二部分,选择Wister大鼠,随机分为二组,A组:马兜铃酸实验组 (n=30),给予腹膜内注射马兜铃酸,剂量为5mg·kg-1·d-1,共给药16周,16周后停药观察,在用药后8、12、16、20、24周分别处死6只大鼠。B组:正常对照组(n=6):给予腹膜内注射生理盐水每只2ml·d-1,共16周。通过血、尿生化检测、光镜观察及体视学测量、免疫组化检测、细胞总RNA的提取及电泳鉴定等方法观察马兜铃酸诱发小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞在肾间质纤维化过程中的作用,以及TNF-α在转分化过程中有无特异性表达。第三部分,选择Wister大鼠32只,对照组8只,仅行假手术,其余24只在无菌条件下行单侧输尿管结扎术诱发肾间质纤维化模型,术后随机分成治疗组和模型组,治疗组于UUO手术第一天起给中药,根据动物体重,高、低两个剂量灌胃,分别是4.0g·kg-1·d-1和2.0g·kg-1·d-1,每一剂量8只动物,模型组8只动物予等量温水。通过免疫组化检测肾小管组织波形蛋白(vimentin,Vim)、角蛋白(cytoketatin,CK)以及?-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达,并定量分析肾小管上皮细胞内免疫组化阳性面积和肾小管上皮细胞总面积的比值,取其平均值为每例标本肾小管上皮细胞阳性表达的比较值。结果:第一部分,TNF-α(50,100ng/ml)诱导HKC细胞失去表达钙粘蛋白和角蛋白,表达α-SMA和波形蛋白,细胞培养上清液的纤粘连蛋白和I型胶原浓度明显增高;TNF-α(50,100ng/ml)与TGF-β(8ng/ml)联合作用组HKC细胞表达α-SMA,细胞培养上清液纤黏连蛋白及I型胶原的浓度均明显高于各单独作用组(P<0.05);TNF-α(50ng/ml)和TGF-β(8ng/ml)从24小时起明显增加纤黏连蛋白和I型胶原的浓度,72小时内继续升高,(P<0.05)。第二部分,在马兜铃酸肾间质纤维化动物模型中,血BUN及Scr在用药16周后比对照组有显著升高(P<0.05),停止用药后血BUN未见下降,反而继续升高;大体标本可见肾表面光滑,未见凹凸不平,马兜铃酸组肾皮质在16周后变薄,肾脏重量与对照组比较下降、尤以16-24周后下降明显(P<0.01);免疫组织化学可见马兜铃酸组16周后(-SMA和波形蛋白在肾小管上皮细胞胞浆内有少量表达,在20周时表达明显增加,24周时表达进一步增强;而16周后角蛋白表达开始减弱,但在20、24周时表达进一步减少,与对照组相比有显著性差异(P<0.01);对照组无TNF-α、TGF-?……   
[关键词]:肾间质纤维化;马兜铃酸;肿瘤坏死因子;小管上皮肌成纤维细胞转分化;补肾活血法
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:河北医科大学2004年