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重组人白细胞介素10的融合表达及功能学初步研究

方爱平

  目的:白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)是由单核-巨噬细胞分泌的一种蛋白质,相对分子质量约为21000Da。IL-10具有多种生物学活性,是一种多功能细胞抑制性因子,可抑制单核—巨噬细胞、T淋巴细胞等炎症细胞的激活及多种炎症因子如IL-1β,肿瘤坏死因子α(TNF-α),IL-6,IL-8,IL-12等的合成,在炎症免疫反应,肿瘤,病毒感染,造血系统,心血管系统等多方面发挥着重要的作用。本实验构建表达人重组白细胞介素10(recombinant human interleukin 10,rhIL-10)融合蛋白分子,通过Ni柱进行亲和层析,获得一步纯化的表达产物,为进一步研究IL-10在临床疾病应用中的作用机制奠定基础。方法:1、应用RT-PCR方法扩增IL-10基因,克隆PCR产物,构建hIL-10重组质粒,以AppiedBiosystems 3700 DNA分析仪进行分析。采用构建成功的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞,12%SDS-PAGE和免疫印迹鉴定融合表达蛋白。2、离心分离包涵体(IBs),将IBs溶于7M尿素中,然后通过Ni柱进行亲和层析,以获得一步纯化的表达产物,纯化产物稀释复性。3、以外周血单核细胞为研究对象观察纯化产物重组人IL-10对外周血单核细胞分泌TNF-α的抑制作用。结果:1、用RT-PCR方法扩增IL-10基因,成功构建IL-10质粒,此质粒在BL21(DE3)pLyse中得到高效表达。2、rhIL-10经Ni柱纯化后纯度为80.42%、回收率为66.72%。3、对重组IL-10与TNF-α之间的关系的研究表明,随着重组IL-10浓度的增加,单核细胞分泌TNF-α的含量逐渐减少,并且与对照组相比差异存在显著性,表明IL-10可抑制TNF-α的分泌。结论:成功构建重组hIL-10质粒载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞内高效表达。纯化样品经稀释复性后,对单核细胞分泌致炎因子的功能有抑制作用。……   
[关键词]:人重组白细胞介素10;融合表达;包涵体;复性;Ni柱亲和层析;TNF-α;细胞培养
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:武汉大学2004年