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磺胺类药物残留酶免疫分析的研究

房超

  磺胺类药物是兽医临床上使用最广的一类化学合成抗菌药,主要用于细菌感染性疾病和某些原虫病的预防和治疗。但使用不合理很容易造成组织中的残留和蓄积。许多国家和组织规定了其最高残留限量(MRLs)为0.1μg/g,甚至不得检出。高效液相色谱、气-质联用等是磺胺类药物残留检测的法定方法,但成本较高,方法繁琐,不适于大量样本的测定。酶联免疫法(ELISA)检测具有特异性强、灵敏度好且适合大批样本快速测定的特点,在兽药残留检测上的应用日益广泛。关于各磺胺类药物残留免疫法检测的研究已有较多报道,但关于磺胺类药多残留(multi-residues)检测的研究才刚刚起步,而且在理论和实践中有许多问题需要解决。本研究通过化学法合成了两种具有磺胺母核结构的半抗原,制备了对多种磺胺药具有敏感性的多克隆抗体,并对多残留免疫分析的基本规律进行了探讨。另外,研制了磺胺甲基异噁唑(SMZ)抗体,建立了SMZ的ELISA检测方法,并应用于牛奶中SMZ残留的检测。用对乙酰氨基苯磺酰氯(ASC)和对氨基苯甲酸(PABA)为反应原料,经过亲核取代、水解等化学反应,合成了保留磺胺药母核结构的半抗原化合物H1、H2,经紫外扫描、红外光谱、质谱、核磁共振以及免疫法鉴定为预期产物。用活性酯法和混合酸酐法将半抗原与载体蛋白偶联,制备了人工抗原,两种免疫原H1-HSA、H1-BSA的结合比分别为10.3:1和9.6:1。用H1-HSA偶联物免疫兔子,制备了抗磺胺类药物抗体,抗体效价在1:10万以上。间接竞争ELISA表明,5种常用的磺胺药SO、SMM、SMD、SMZ、SC的检测限分别为0.065、0.046、0.045、0.032、0.015μg/ml,低于最高残留限量0.1μg/ml。但SD、SM_2的检测限较高为0.86、1.0μg/ml。抗体有较高的特异性,常用的4种抗生素和3种磺胺类药结构类似物与抗体无交叉反应,制备了酶标半抗原,并进行了直接竞争ELISA试验。试验结果表明磺胺药N~1端R取代基的空间位阻、电子云和电荷的分布与密度是决定抗体识别药物的重要因素。在牛奶介质中各药物的检测效果优于PBS介质中,添加SO的回收率为76.5%~107.4%,建立的间接竞争ELISA法基本能满足磺胺药多残留定性检测的要求。用戊二醛将SMZ与载体偶联,以SMZ-BSA为免疫原制备了多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体具有较高的检测灵敏度和特异性,以其建立了测定SMZ残留的间接竞争ELISA方法。以SMZ浓度的对数为横坐标,药物对抗原抗体反应的抑制率为纵坐标,绘制了标准曲线。经计算,该方法的检测限是8.74ng/ml,定量限为71.46ng/ml,低于最高残留限量100ng/ml,抗体与其它6种磺胺药的交叉反应<0.1%。比较了两种ELISA反应模式进行,发现抗体各作用40分钟时检测限没有降低。在牛奶介质中检测的灵敏度更高,检测限为6.14ng/ml,定量限25.4ng/ml,IC_(50)值为398ng/ml,添加回收率为71.6%~106%,RSD4.5%~10.27%,符合残留检测的要求,可用于SMZ残留测定。……   
[关键词]:磺胺类药物;半抗原;多残留;ELISA;磺胺甲基异(口恶)唑
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:扬州大学2004年