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林蛙抗菌肽的制备与制剂研究

田晓乐

  各种感染性疾病日益严重地威胁着人类的生活,虽然新的抗生素不断产生,但是随之而来的细菌抗药性也日益增强,新型抗感染药物的开发日趋显得重要。抗菌肽是在诱导条件下,由动植物体中产生的一类分子量在4KDa左右的免疫多肽。它具有较小的分子量,良好的耐热性和较小的抗原性,因而具有广泛的抗菌活性。某些抗菌肽还具有抗病毒,抗真菌及抑制癌细胞生长的作用,而对人体细胞没有损害。因此,抗菌肽有望发展成为一种新型抗菌、抗肿瘤药物,而对人类健康产生深远的影响。抗菌肽首先由瑞典科学家G. Boman于1975年发现的—天蚕素(Cecropins)。随后又在其它生物体内陆续发现了700百多种肽类抗生素,包括细菌、真菌、昆虫、被囊动物、两栖类动物、甲壳类动物、鸟类、鱼类、哺乳动物(包括人类)以及植物在内的所有生物体都可产生抗微生物肽。每个动物体内含有许多不同种类的抗微生物肽,如蛙皮素(Magainins),蜂毒素( Protegrins, Melitins),防御素(Defensins)等。目前发现的内源性抗菌肽都是由12-45个氨基酸残基组成的典型的双亲性小分子,等电点多大于7,具有较强的热稳定性。有些抗菌肽是组成性表达,有些是在损伤或感染等刺激后产生,它们的N端富含赖氨酸、精氨酸等氨基酸残基,因而具有表面活性剂的作用。根据它们的特性可以分为以下几类:1)以Cecropins为代表的具有螺旋结构的线性多肽,它们对革兰氏阳性或阴性细菌均有作用;2)富含某种氨基酸的线性多肽,如富含脯氨酸的蜂毒素Apidaecins;3)含有一个二硫键的多肽,如来源于牛中性粒细胞的Bactenecin;4)含有两个或两个以上二硫键的多肽,其典型代表是Defensins,在动植物体内均有存在,目前已商品化。总之,抗菌肽的结构特征多样,但也具有某些保守的共同特征。蛙类是两栖纲中形态比较特化的一个类群,分布广泛,除南极洲外全球均有分布,以温差小而湿度大的热带、亚热带为多。蛙类皮肤裸露、潮湿,这无疑给微生物提供了一个极好的生存环境,但在长期的自然选择过程中,它们逐渐形成了防御机制,即由背部及腹部皮肤分泌分泌物来抵御有害环境因子的侵袭。分泌物的主要成分是多肽,包含神经肽、毒素、麻醉剂、激素、抗微生物和抗真菌剂等。目前,对抗菌肽的作用机制尚无定论。大多数抗菌肽具有抗细菌作用,研究发现,Magainins等可形成双亲螺旋结构,作用于细菌细胞膜,在膜上形成离子通道,引起胞内物质外漏而杀死细菌,但胆固醇的存在会减弱其裂解作用。此外,许多抗菌肽还具有抗病毒作用,其机制是直接与病毒粒子相结合或干扰病毒的繁殖和侵染过程。从目前得到的蛙类抗菌肽看来,大多数蛙类抗菌肽含有的氨基酸残基数目都在21到27个之间,且具有形成两亲的α-螺旋结构的倾向。抗菌肽的氨基酸残基的替换,只要是有利于形成两亲α-螺旋结构的,一般都会提高抗菌肽的抗菌活性。且它们大多都是碱性多肽,容易与酸性的生物膜的层状排列的脂类双分子层相结合,依靠两亲的α-螺旋结构的特点形成跨膜的离子通道,介导一系列的生物效应。Jacob等认为抗菌肽的杀菌机理是这些抗菌肽依赖两亲的α-螺旋结构,作用于细菌细胞膜的层状排列的脂类双分子层,使细菌细胞膜破裂,并最终导致细菌细胞壁的溶解。由D-氨基酸构成的对映体一般与天然存在的抗菌肽具有相同的活性,这说明抗菌肽的作用机理与酶或受体等蛋白因子无关,它们主要是作用于膜脂质的基质,通过物理化学机制作用于细胞骨架,使膜的通透性增大,形成贯通膜的离子通道;但是其详细的分子学作用机制仍不清楚。另外,像Magainins家族这样的抗菌肽,它们是如何识别微生物膜和动物细胞膜也不十分清楚。抗菌肽具有较高的热稳定性及较低的毒副作用,在医疗、食品及动植物抗病虫害研究中都得到了广泛的应用。由于抗菌肽的产生被认为是与感染引起的局部反应有关,因此它被用来治疗炎症,且对革兰氏阳性菌及阴性菌都有作用,同时不易产生耐药性,因而也用来治疗常规抗生素效果不明显的感染。但是,由于抗菌肽成本较高,这些应用在目前还很有限。凝胶剂是近年来为满足临床需要而发展起来的一种新型制剂,它是利用一些新型的高分子药用辅料如卡波姆(Carbomer、Carbopol)、羟甲基纤维素钠(CMC-Na)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)等将药物制成凝胶,从而达到提高药物局部浓度、延长药物的释放或扩散过程的目的,具有比其它剂型生物利用度高、稳定性好,不良反应少的特点,被广泛应用于临床。基于抗菌肽具有较好的应用前景,首先,我们进行林蛙抗菌肽生产工艺的优化——筛选活性较高的林蛙蛙皮;通过正交试验设计,确定最佳的抽提条件;并对林蛙抗菌肽的生产工艺进行简化,以适应工业化生产的要求;其次,针对得到的抗菌肽进行性质表征,包括分子量范围、对临床多重耐药菌的抑菌活性(MIC和MBC测定),及其镇痛活性和对温度、pH的稳定性;最后,根据林蛙抗菌肽的性质,进行制剂的研究。通过正交试验确定林蛙抗菌肽喷雾剂和凝胶的最佳配方,并进行含量测定及其对临床多重耐药菌的抑菌活性;通过离心法和经典恒温加速法检测制剂稳定性,确定有效期,为今后的临床?……   
[关键词]:林蛙;抗菌肽;临床多重耐药菌;抑菌圈;最低抑菌浓度;最低杀菌浓度;喷雾剂;凝胶剂
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林大学2004年