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16SrRNA检测在螺杆菌感染与肝癌相关性研究中的应用

施永新

  目的采用分子生物学技术,从分子水平上通过检测螺杆菌16SrRNA基因,探讨螺杆菌感染与原发性肝癌(HCC)之间的相关性,为原发性肝癌病因和发病机制提供新的思路,同时对原发性肝癌的临床诊断和防治开辟新的途径。方法①从Genebank基因文库中下载已知所有螺杆菌属16SrRNA序列,利用DNAstar软件包与大肠埃希菌、溶血链球菌和嗜肺巴氏菌的16SrRNA的高保守区序列比较,优化并设计出一对属特异螺杆菌共用引物、反应参数和一个属特异螺杆菌DNA探针,分别用于PCR扩增和Southern杂交确认。②选择术后原发性肝癌组织15例为实验组;胃癌、非原发性肝癌、结直肠癌和子宫肌瘤各15例为对照组。原发性肝癌组和胃癌组癌组织块一部分制成匀浆提取DNA,用于PCR和Southern实验,另一部分和其它对照组制作病理切片用于原位杂交实验。③合成Battle设计的肝螺杆菌(Hh)、幽门螺杆菌(Hp)、H.Fennelliae(Hf)16SrRNA-cDNA特异探针和我室设计的属特异螺杆菌16SrRNA-cDNA共用探针,利用地高辛3’-末端标记法标记探针,检测各组切片标本16SrRNA-mRNA的表达。④对经PCR扩增、Southern杂交和原位杂交确认的原发性肝癌组阳性标本DNA进行序列测定,以验证螺杆菌感染类型。结果①PCR技术检测15例原发性肝癌患者结果9例螺杆菌16SrRNA基因阳性,并将阳性标本作Southern杂交,证实为螺杆菌属16SrRNA基因。②原位杂交法检测实验组和对照组螺杆菌属16SrRNA-mRNA表达,结果显示原发性肝癌组9例阳性、胃癌组10例阳性,阳性率分别为60.0%、66.7%,检出率均较高,但两组间比较P值>0.05无统计学意义;非原发性肝癌组和子宫肌瘤组皆为阴性,结直肠癌组有1例阳性,原发性肝癌组分别与这三组比较P<0.05,均有统计学意义;另外对阳性标本继续作肝螺杆菌16SrRNA-mRNA检测未获得阳性结果。③原发性肝癌组阳性标本16SrRNA基因序列测定和比对结果表明,与幽门螺杆菌(H.Pylori,Hp)16SrRNA基因序列同源性最高,达到97.8%,与H.Fennelliae的同源性最低,为80.9%。结论①经PCR扩增和Southern杂交确认结果显示,在原发性肝癌和胃癌组织中均检出16SrRNA基因,表明两种肿瘤可能均伴有螺杆菌感染。②原位杂交法检测16SrRNA-mRNA表达和16SrRNA基因序列测定证实,阳性标本均为幽门螺杆菌(Hp)感染,提示幽门螺杆菌感染可能与原发性肝癌的发生有相关性。③原发性肝癌组未中文摘要检出肝螺杆菌16SrRNA基因和肝螺杆菌16SrRNA--mRNA表达。……   
[关键词]:原发性肝癌;螺杆菌感染;16SrRNA基因;PCR;原位杂交;序列测定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:青岛大学2003年