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沙冬青抗冻蛋白的分离纯化及特性鉴定

王维香

  抗冻蛋白(AFPs,ntireeze roteins)是一类能吸附到冰晶表面并抑制其它水分子与冰晶结合的蛋白质。吸附到冰晶上的抗冻蛋白具有热滞活性和修饰冰晶形态功能,有利于降低组织细胞的冰冻损伤。测定热滞活性和观察冰晶形态是鉴定抗冻蛋白的两个重要指标。利用改进的显微镜冰晶形态观察法,从豆科植物沙冬青(A.Mongolicus)冬季叶中分离纯化到两个抗冻蛋白:amAFP28和amAFP37,并对amAFP28的一些理化性质进行分析,为通过基因转化手段提高农作物抗冻性奠定基础。用缓冲液Ⅰ(50mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,10mmol/L EDTA,20mmol/L Vc)提取的冬季沙冬青叶粗提液,经一系列层析技术包括DEAE-cellulose A52弱阴离子交换层析、Superdex 75 prep grade分子筛层析和POROS20HP2灌注疏水层析,分离到具有抗冻活性的复合物:SDS-PAGE为34.7 kDa和37.1 kDa两条蛋白带。对SDS-PAGE电泳条带进行回收,活性检测表明,37.1 kDa蛋白带具有修饰冰晶形态功能,其热滞活性在5mg/mL蛋白浓度时为0.24℃(渗透压法),此为amAFP37。用缓冲液Ⅱ(25 mmol/L Tris-HCl,pH7.4,0.1 mmol/L EDTA,1mmol/L PMSF,0.1 mol/L KCl)提取的冬季沙冬青叶粗提液,在100℃加热15分钟后,经DEAE-cellulose A52弱阴离子交换层析、Sephacryl S300 HR分子筛层析、POROS20HP2灌注疏水层析和Source 15Q强阴离子交换层析,纯化得到热稳定抗冻蛋白amAFP28。amAFP28经SDS-PAGE测定分子量约为28kDa,其热滞活性在蛋白浓度为10mg/mL时为0.15℃(渗透压法)。amAFP28的pI为6.68,不含碳水化合物,其最大的紫外吸收值是278nm,最小的紫外吸收值是250nm。二硫键不是amAFP28抗冻活性所必需的。amAFP28富含亲水性氨基酸残基Asp,Thr,Glu以及小分子量氨基酸残基Ser,Ala和Val。圆二色谱(CD)显示amAFP28的二级结构组成为:α-螺旋17.2%,平行β-折叠和β-转角4.1%,反平行β-折叠39.7%,无规卷曲和γ-转角34.4%,-S-S-和芳香氨基酸4.6%。二硫键拆合对amAFP28的二级结构没有影响。amAFP28分子的N-端焦谷氨酰化封闭,测定的N-端氨基酸部分序列是GKSINHLPGQND。冬季沙冬青叶非质体中有抗冻蛋白。……   
[关键词]:沙冬青(A.Mongo/icus);抗冻蛋白(AFPs);分离纯化;物理化学特性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:大连理工大学2004年