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绿脓杆菌外毒素转位结构域的结构与ImmunoGrB融合蛋白肿瘤杀伤功能关系的研究

张莉

  将治疗性的蛋白或基因有效的导入细胞,从而达到药物或者基因治疗的目的,是治疗恶性肿瘤一直的研究领域。但由于细胞膜的通透性低,使得这一方法困难重重。效应分子能否有效地通过细胞的膜性结构,也是当今恶性肿瘤的基因治疗中首先要解决的问题。近年来发现的一些蛋白或其某部分结构域可以穿越细胞的膜性结构,将效应分子运送到细胞浆甚至细胞核,并称这种具有转位功能的蛋白或者多肽为转位蛋白或细胞穿透肽。Pseudomonas exotoxin A(PE)是绿脓杆菌分泌的单链毒素,由613个氨基酸(aa)组成,分为三个主要结构域:Ia(1-252aa)与识别并结合靶细胞功能相关;Ⅱ(253-364 aa)具有内吞体转位活性;Ⅲ(400-613aa)催化EF-2的ADP-核糖基化而失活。此外还存在一个小结构域Ib(365-399 aa),功能尚未明确。PE分子与细胞膜上相应的受体结合后进入细胞形成内吞体,在内吞体的酸性环境中,Furin蛋白酶识别PE转位结构域中的成对碱性氨基酸序列,切割Arg~(279)-Gly~(280)之间的肽键,从而释放催化结构域穿过内吞体膜进入胞浆。第四军医大学硕士学位论文PE的转位结构域己广泛应用于基因和蛋白转移的研究中,它可以帮助效应分子从内吞体转位至胞浆,发挥其生物学效应。但是关于PE转位结构域的有效长度各文献报道不一致。截短转位结构域,找到最小且又不丧失转位功能的转位功能区,可以很大程度的减小转位结构域对其C端效应分子的空间位阻效应,而且整个融合蛋白的分子量因此可以减小,应运于人体时可以降低其免疫原性,从而更好地发挥融合蛋白的作用。本文构建了编码三种包含不同长度PE转位结构域:1)PE(275一358aa);2)PE(275一280aa);3)无PE的重组抗体粒酶B基因(e23sFv一PE 11 .GrB),即将不同截短型PE转位结构域的N端和C端分别与针对HER-2的单链抗体基因和活性型的邵翅u,meB(C廿B)基因相连,或将单链抗体基因直接与G‘基因相联接并将它们命名为L切m助oGrB(PE275一358)、Inun咖份B(PE275一280)和ImmunoGrB(PE一null),均与PE转位结构域为253一358aa的I~un创GrB(PE253一358)进行比较。实验结果证实:各种Lnm~(扮B融合蛋白无论截短与否,均可以特异识别进入HER-2阳性的SKBR-3细胞。在内吞体酸性环境中,含有PE转位结构域的玩叻助州玉丑裂解得到的PE.OrB被转位到细胞质中,最终均可以导致细胞凋亡,但作用时效不同,其中InunUnoC扮B(P E253一358)和IIIununOGrB(pE275一358)诱导细胞凋亡所用时间最短,对细胞的生长抑制能力最强;而随着转位结构域截短至P域275一280)后,所转染细胞出现凋亡的时间推迟,细胞生长抑制率降低;而无PE的Inununo(扮B(PE一null触合蛋白不具有细胞杀伤活性。将所构建重组基因表达质粒用脂质体包裹,肌肉注射荷有HER-2阳性SKBR一3肿瘤的裸鼠,与体外细胞水平实验有所不同,含有PE转位结构域的三种玩皿叨以孔B:Irnrnun0C计B(PE253一358)、玩叨边目山丑少E275·358)和l~卿GrB(PE275一280)均具有较高的体内抑瘤活性,动物存活时间均能延长,三组之间无显著统计学差异。免疫组化结果显示,表达的玩叻也心山侣融合蛋白可以选择性的高分布于裸鼠的肿瘤组织中,而在其他正常组织如心、一4一第四军医大学硕士学位论文肝、脾、肺、肾中染色呈阴性或弱阳性,而I~unoGrl双PE一null)治疗组,虽然可以选择性的分布在肿瘤组织内,但由于其不具有肿瘤细胞杀伤活性,肿瘤体积大小及动物生存时间与空载体对照组相似。本文进一步将含有I~unoG洲PE253一358)基因构建到重组逆转录病毒载体上,获得pLNCX一ImrnunoGrB(P E253一358)(P E253一358),转染进队317细胞系进行包装,获得了滴度较高的单克隆包装细胞株。应用含In””unoGrB基因的逆转录病毒体外感染T淋巴细胞进行,然后将感染后得到的T淋巴细胞经尾静脉注射裸鼠,体内抑瘤实验,观察到该方法可以使裸鼠肿瘤生长速度减慢,存活时间延长,为修饰的淋巴细胞回输策略提供了实验依据。综上所述,当PE转位结构域截短至275一358aa时,转位活性与PE(253一358)相同,说明去除PE253一274位点之间的氨基酸残基,不会影响Furin蛋白酶对沁9279一Gl尹80位点的识别及切割,随后PE(280-358卜。旧融合蛋白穿过内吞体膜进入细胞浆,诱导细胞发生调亡:PE转位结构域在仅有275.280aa时仍然可以发挥其转位功能,但细胞水平上发现肿瘤细胞发生凋亡的时间推后,对细胞生长的抑制能力在总体水平上减弱,可能是由于缺少281位到358的氨基酸,PE(280aa卜GrB穿过内吞体膜的能力减弱,速度降低,加上部分In”nun以孔B(PE275一280)分子在内吞体中被降解造成。PE转位结构域完全去除后,lmmUn创GrB(PE-null)仍然可以靶向识别并进入细胞形成内吞体,但是被滞留在内吞体中,不能进入细胞浆,内吞体中的溶醉体酶很快将其降解,少量进入胞浆的In”nunoGrB(PE一null)融合蛋白,由于抗体分子对GrB分子的空间位阻影响GrB活性中心的形成,因而不能杀伤SKBR一3细胞。本研究探讨了PE转位?……   
[关键词]:基因治疗;肿瘤;粒酶B;HER-2;抗体;绿脓杆菌外毒素;转位结构域
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第四军医大学2004年