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Linker插入的乙肝病毒靶向核糖核酸酶的构建及其抗病毒活性的研究

宫卫东

  HBV感染是当今最严重的健康问题之一,常会引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。目前主要的预防策略是接种疫苗,但有5%的人对疫苗不反应。目前针对HBV感染的治疗有四大类方法:1)α-干扰素。其有效率仅为30%—40%;2)核苷类抗病毒药物。如拉米呋啶、泛昔洛韦等需长期用药,而长期用药可诱导HBV产生耐药性;3)免疫学治疗。慢性乙肝的发生与细胞免疫功能不全有关。应用免疫学的方法来阻止感染后免疫耐受的产生,包括治疗性疫苗,免疫活细胞移植及免疫细胞因子。但这些手段均处于实验阶段;4)基因治疗。如核酶、反义寡核苷酸、显性负性突变体及siRNA等,这些方法也均是在细胞模型或动物模型体内进行,离临床应用尚有漫长的道路。总之,现有的各种手段对于预防和治疗乙肝病毒的感染有一定的效果,但仍迫切需要探索治疗的新方法。本研究室根据核衣壳导向的病毒灭活(CTVI)这一抗病毒策略设计了HBVc与hEDN的融合蛋白,即靶向核糖核酸酶(targeted-ribonuclease,TR),第四军医大学博士学位论文在体外细胞模型用真核表达载体peDNA3 .l(一)转染已成功地抑制了乙肝病毒的复制。为进一步探索提高TR的抗HBV效率,我们在HBVc和hEDN之间引入了经典的linker一一(Gly4Ser)3,即为TR一L,以期通过更好地维持两个功能域HBVc和hEDN的天然构象,减低它们的空间位阻来增强融合蛋白的抑制效率。同时为了进一步将其应用于小动物模型,并为将来可能的临床应用作准备,本研究中还构建了TR一L的重组腺病毒载体RAd,并在细胞模型上检测了其抗HBV的效率。首先,将合成的两条寡聚核昔酸链退火形成hnker,克隆入peDNA3 .1C)汀R中形成peDNA3.l介)舰Be一linker质粒。以peDNA3.l〔)/TR为模板,PeR扩增hEnN并克隆入peDNA3.lC)舰Be一linker形成peDNA3.l卜)舰Be一L一hEDN质粒[peDNA3.l〔)/TR一L』,即为有linker插入的乙肝病毒靶向核糖核酸酶真核表达载体。其中靶向分子HBVc与效应分子hEDN之间为hnke:隔开。经转染2.2.巧细胞后,IFA显示,转染peDNA3.1(~)汀又一L的2.2.巧细胞出现较强绿色荧光,说明peDNA3.1(.)汀R.L在2.2.巧细胞内有表达。转染peDNA3.1(.)几又.L、peDNA3.1(.)厅R、peDNA3.l(.班卫mut、PcDNA3.l(一)舰BVc、peDNA3.1(.冲£ DN以及空载体peDNA3.l(一)至2.2.巧细胞同时设立空转染为全阴性对照,48小时后取细胞上清,应用犯A测定HBsAg、HBeAg含量:TR~L及仪组的细胞上清中HBsAg、HBeAg的浓度与其它对照组相比有明显下降(尸<0.01),各对照组细胞上清中浓度差异没有统计学意义(P>.05);TR-L组与TR组相比有差异(尸<0.05)。TR一L组与空转染组相比,上清中HBsAg、HBeAg的浓度分别下降了 51 .9%、61.4%。荧光定量PCR法测定上清HBV-DNA含量显示:实验组细胞上清中HBV-DNA的含量与对照组相比有明显下降(尸<0.01),各对照组细胞上清中含量差异没有统计学意义(p>.05):TR.L组与TR组相比有差异(P<0.05)。TR一L组与空转染组相比,浓度下降了49.9%。各组转染后观察细胞形态无明显变化,M仃比色分析显示,各组4第四军医大学博士学位论文间差别无统计学意义(P>0.05),说明细胞增殖并没有受抑制。为了更好的观察和证实我们构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶在体内的作用,本实验换用重组腺病毒载体RAd为后续的体内试验及功能研究打下基础。首先构建带目的片段的腺病毒穿梭质粒,将各目的片段TR一L、TR、TRlnut、HBVe、hEDN,克隆入腺病毒穿梭质粒pDC3 16。在293细胞中包装形成含目的片段重组腺病毒、鉴定、扩增及滴度测定。获得的各病毒滴度分别为(107p细ml):RA出TR一L:4.1:RA价R:4.5;KA盯Rxnut:3.7:RAd儿EDN:5.6:RA出HBVc:6.3:RA出空:5.7。用获得的重组腺病毒感染2.2.巧细胞后,IFA显示,感染RAdjTR一L的2.2.巧细胞出现较强绿色荧光,说明RA山叮R一L在2.2.巧细胞内有表达。以重组腺病毒分别感染2.2.巧细胞,同时设立空感染为全阴性对照,48小时后提取细胞上清,应用IUA测定HBsAg、HBeAg含量显示,RAd/TR一L及RA山丁R细胞上清中HBsAg、HBeAg的浓度与其它对照组相比有明显下降(尸<0.01),各对照组浓度差异没有统计学意义(P>.05):TR一L组与TR组相比有差异(尸<0.05)。TR一L组与空感染组相比,上清中HBsAg、HBeAg的浓度分别下降了65.3%、62.7%。荧光定量PCR法测定上清HBV-DNA含量:TR一L组与TR组细胞上清中HBV-DNA的含量与对照组相比有明显下降(P<0.01),各对照组含量差异没有统计学意义(P>.05):TR一L组与TR组相比有差异(P<0.05)。TR一L组与空感染组相比,浓度下降了59.9%。各组细胞感染后观察形态与感染前无差别,M竹比色分析显示,各组间差别无统计学意义,说明细胞增殖未受抑制。以上结果表明,linke:的插入可能通过优化HBVc和hEDN分子之间的空间构象降低其空间位阻而增强TR的抗HBV效率。尽管诸多实验条件如细胞状态、细胞数量、细胞代数等不同,但从TR.L真核表达载体及TR.L重……   
[关键词]:HBV;Linker;CTVI;基因治疗;腺病毒载体
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第四军医大学2004年