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当归多糖的组成分析及其激活腹腔巨噬细胞的免疫机制

杨兴斌

  研究目的:当归为伞形科多年生草本植物,是中医内、外、妇、儿各科常用的主药,其主要功能为补血和血、调经止痛,兼有滋补强壮、扶正固本及活血化瘀之功效。当归的主要成分为多糖、阿魏酸、挥发油等。其中,当归多糖是主要水溶性成分,且具有广泛的生物活性,成为当归药效物质基础的研究热点。但多糖研究正面临着质量控制、作用机理等目前亟待解决的“瓶颈”问题。因为多糖是不同分子量大小的混合物,难于质量控制;此外,多糖是大分子化合物,不能透过细胞膜,在胃肠道几乎不吸收,而多糖经口服、腹腔注射、静脉等途径给药均有较好的药效,这提示,多糖可能作用于细胞膜受体而介导免疫应答。但其激活机制还不清楚,主要是还尚未鉴定是哪种膜受体起关键作用。而Toll样受体4(TLR4)是近年发现的重要内毒素脂多糖(LPS)受体,是机体天然免疫系统的重要组成部分,在识别病原体,启动NF-κB通路,促进NO、TNF-α等细胞因子分泌中起关键作用。最新研究表明,几种细菌多糖可作用于TLR4表面分子而激活巨噬细胞、T细胞和B细胞,认为TLR4可能是该多糖的受体。为此,本文针对当归多糖研究中存在的主要问题,拟集中建立当归多糖组成测定的高效液相色谱(HPLC)质控技术,并以小鼠腹第四军医大学博士学位论文腔巨噬细胞的TLR4为当归多糖的候选作用靶点(受体),研究中药植物当归多糖是否通过TLR4介导腹腔巨噬细胞的激活,揭示当归多糖的作用机理。研究方法:以崛县当归根为药材,采用水煮、乙醇沉淀、透析、反复冻融除蛋白、冷冻干燥等方法制备粗多糖,并经葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化为不同的多糖组分。用IR、UV、元素分析、旋光度等常规分析方法从不同角度反映多糖的纯度、理化性质等基本特征。在采用目前较成熟的气相色谱(GC)法测定多糖组成的实验基础上,通过1一苯基一3一甲基一5一毗咪酮(P MP)柱前衍生化高效液相色谱法,建立常规紫外检测和C,8柱分离分析多糖组成的新方法。同时,从BALB/c纯系小鼠分离腹腔巨噬细胞,进行原代细胞培养;采用过氧化氢(HZO:)和叔丁基过氧化氢(tBOOH)为活性氧(ROs)实验损伤剂(激活剂),建立巨噬细胞损伤模型,观察当归多糖对ROS激活的巨噬细胞释放NO的影响及其抗损伤保护效应。此外,采用M竹、紫外可见分光光度法等方法研究当归多糖对正常巨噬细胞释放细胞因子等免疫活性的影响,并采用免疫组化、Rl’- PCR等技术研究当归多糖对巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和TLR4基因表达的影响,揭示多糖作用机理。实验结果:当归经水提、醇沉、反复冻融除蛋白等方法,成功地实现多糖的分离纯化;制备的粗多糖CAP呈白色,提取率达10%以上;为实现均一、药效稳定的目的,CAP进一步经Sepha卿l一5 400凝胶层析柱(94 X sem)分离纯化为”FI,^PFZ和APF3三个明显的组分。元素分析、紫外扫描、旋光度测定、分光光度分析等实验结果表明,该提取工艺得到的当归多糖组分APFI和妙FZ未发现有蛋白质或核酸等杂质的存在;但CAP及其组分APF3发现含有少量蛋白质,表明采用本室建立的反复冻融第四军医大学博士学位论文除蛋白方法,其除蛋白效果较为理想。药效实验表明,APFI,APFZ和APF3均有抗氧化损伤、抗肿瘤、激活巨噬细胞等功效,各组分的生物活性顺序为APF3>APFZ>APFI。其中,APF3与APFZ活性相当,但APF3稳定性较差,药效重复性不理想,这可能与其结合的蛋白等杂质有关,而以APFZ为当归多糖的代表组分进行药效评价可得到较稳定和理想的结果。GC分析结果表明,CAP及其组分APFI、APFZ和APF3的单糖组成摩尔比各不相同。CAP由鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Gle)、半乳糖(Gal)组成,其摩尔比为1.00:2.72:0.72:4.00:2.32:APFI由Rha、Ara、Gle、Gal组成,其摩尔比为1.00:2.27:7.80:2.69;APFZ由Rha、Aia、Man、Gle、Gal组成,其摩尔比为1 .00:5.29:3.66:9.11: 5.17:APF3由助a、Ara、Man、Gle、Gal组成,其摩尔比为1 .00:4.54:2.98:1 1.09:7.45。采用PMP柱前衍生化HPLC法,首次成功地实现当归多糖的单糖组成分析;并建立了当归多糖水解样品及其PMP衍生化样品的制备优化工艺。本样品制备方法无任何干燥过程,而是将多糖水解液直接用NaOH中和(约中性),而后溶液直接进行PMP衍生化,氯仿萃取后的水层溶液进样分析。该方法避免了传统多糖水解产物的干燥以及PMP衍生化溶液再次干燥的复杂烦琐过程。这对于发展多糖的定性定量在线分析技术有重要的理论和实际意义。该制备方法具有如下特点:①简化工艺、避免糖的干燥损失;②改进后的样品制备工艺,节约2/3的时间,而对多糖的组成测定无影响;③可用于多糖和单糖的在线大批量定性定量分析监测。HPLC分析结果表明,CAP由甘露糖(Man)、鼠李糖(灿a)、葡糖糖醛酸(GleUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Gla)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)七种单糖组成,其摩尔比为0.57:1.00:0 .13:3 .06:8.16:7.17:12.69;APFI由Rha、GalUA、Gle、Gal、Ara五种单糖组成,其摩尔比为1.00:2.65:2.02:3.45:10.64;’APFZ第四军医大学博士学位论文由Man、……   
[关键词]:当归多糖;巨噬细胞;组成分析;细胞因子;Toll样受体4;激活机制
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第四军医大学2004年