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两种甲壳动物感光器及其感光器中G蛋白的研究

许燕

  在动物的光电信号传导过程中,G蛋白起着重要作用。G蛋白参与动物的光电转导已在多种脊椎动物中得到证实,Gq-蛋白参与无脊椎动物的光感觉过程也在许多高等的无脊椎动物中被证明。有关无脊椎动物感光器结构与功能的研究,主要集中在果蝇等,而以甲壳动物为对象的研究则很少。对于甲壳动物感光器的研究主要集中在电生理、超微结构等方面,对其生化机理的研究甚少。有关甲壳动物感光器中的G蛋白的研究不多,Gq蛋白是否在甲壳动物的感光器中普遍存在或还有其他形式,G蛋白在其感光器光信号传导途径中的作用和功能的研究等都尚未见有报道。日本沼虾和红螯螯虾,同属甲壳纲十足目长尾亚目,是目前我国主要的具有增养殖前景的淡水经济虾类。为此,本研究以两种甲壳动物——日本沼虾和红螯螯虾为对象,采用光镜、电镜、生物化学、免疫细胞化学和免疫电镜等方法研究其感光器及感光器中G蛋白的类型、存在形式、含量、定位及作用,并将G蛋白存在形式、含量、定位与不同感光传导途径的相关性进行了研究,目的是探讨不同光刺激引起的光信号转导过程中G蛋白的作用,为进一步从细胞和分子水平探讨动物的感光机理提供理论依据。一.红螯螯虾光感受器的形态和超微结构应用光镜和电镜对红螯螯虾的光感受器的形态和超微结构进行了研究。扫描电镜观察显示红螯螯虾的复眼为半球形,复眼除背面有一拇指状的区域无小眼外,其余部分都由小眼组成;小眼多为正方形,面积约为3723.5um~2,复眼表面积约为21.044mm~2。光镜观察显示红螯螯虾复眼的每个小眼从远端到近端分别由角膜、4个角膜生成细胞、4个晶锥细胞组成的晶锥及小网膜细胞构成。透射电镜观察显示红螯螯虾小眼的感光系统由11个小网膜细胞组成,其中4个小网膜细胞位于晶锥之下,构成了感光部分的远端,7个小网膜细胞构成感光系统的近端主体,上下两部分有重叠。两部分的小网膜细胞在结构上有明显差异,上部的4个小网膜细胞的胞质比较致密,但是细胞器种类及数量较下部的小网膜细胞少。红螯螯虾的感光系统有两种类型的感光细胞,可能具有不同的博士学位论文两种甲壳动物感光器及其感光器中G蛋白的研究生理功能。二.光适应与暗适应对红鳌鳌虾光感受器超微结构的影响用透射电镜对光适应和暗适应时的红鳌鳌虾光感受器的超微结构进行了研究比较。结果显示:光适应时感杆束的直径较小,组成近远端感杆束的微纤毛排列零乱;小网膜细胞中的多囊体体积增大,膜下储泡囊体积减小,板膜体、线粒体等细胞器数量较少,色素颗粒分布于整个小网膜细胞。暗适应时,感杆束的直径较大,组成感杆束的微纤毛排列整齐,膜下储泡囊体积增大,多囊体体积减小,板膜体、线粒体等细胞器数量较多,色素颗粒仅分布于小网膜细胞的远端和近端。三.红鳌鳌虾幼体复眼的形态和超微结构应用电镜技术对红鳌鳌虾幼体复眼的形态和超微结构进行了研究。扫描电镜结果表明:刚离开母体的仔虾(体长约Icm)复眼和小眼的形态己接近成体,小眼的平均表面积由1.scm仔虾的90余29.6um2增长为3em仔虾的967士53.3um2和16cm成体的3724士230.3 um,;小眼个数也从体长l.sem仔虾的1001个增加到3cm仔虾的1238个和16cm成体的5652个,红鳌鳌虾复眼的增大是由于小眼面积的增加和小眼数目的增多而引起的。透射电镜结果表明:幼体小眼的基本组成结构也己具备。每个小眼从远端到近端分别由角膜、角膜生成细胞、4个晶锥细胞组成的晶锥及小网膜细胞构成。小眼的感光系统由11个小网膜细胞组成,且与成体一样,H个小网膜细胞已经分化成4十7两层,其中4个小网膜细胞构成了感光部分的远端,7个小网膜细胞构成感光系统的近端主体,远端和近端的小网膜细胞在结构上也有明显差异。随着发育,幼体小网膜细胞内的色素颗粒、细胞器种类和数量、组成感杆束的微纤毛数量、感杆束的直径和间距等均有逐渐增加的趋势,表明复眼的感光结构是逐渐完善的。四.红鳌鳌虾感光器中Gq蛋白的鉴定及光波对其含量的影响以红鳌鳌虾的复眼为实验材料,提取其视网膜可溶性和膜结合蛋白质,用SDS一PAGE和免疫印迹法进行G蛋白的分离和鉴定;并在经光适应、暗适应及博士学位论文两种甲壳动物感光器及其感光器中G蛋白的研究红、绿、蓝、黄四种不同波长光照处理后,对其感光器中G蛋白质分别进行SDS一PAGE分析。结果表明红鳌鳌虾感光器中有Gq蛋白存在,且Gq蛋白。亚基(42kDa)有可溶性和膜结合两种形式。在不同光照条件下感光器中可溶性和膜结合Gq。亚基的含量有差异。在日光和黄光光照下可溶性Gq。亚基含量最高,分别占总蛋白的7.71%和7.犯%,在暗适应和绿光下最低,仅有6.94%和5.74%;而膜结合Gq。亚基的含量则相反,在暗适应和绿光光照下最高,可达到总蛋白的1025%和13.94%,在日光和黄光下最低,只有9.44%和9.76%。以上结果表明红鳌鳌虾感光器中Gq蛋白的激活与光照刺激的波长有关,光器对不同波长光刺激的敏感度有差别。五.红鳌鳌虾感光器Gq蛋白a亚基的亚细胞定位及不同波长光照的影响利用免疫细胞化学的方法和电镜技术观察红鳌鳌虾感光器中Gq蛋白其感……