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磷酸二酯酶抑制剂对IL-1β诱导损伤的离体胰岛细胞的防护作用及其机制

张秀彬

  前言1型糖尿病(diabetes mellitus,DM)是胰岛细胞自身免疫破坏的结果,近年来的实验研究表明:细胞因子(cytokines,CK)引起的胰岛细胞损伤在1型DM的发病中起重要作用,但对其机制尚不明确,大量证据表明细胞程序性死亡(凋亡)是1型DM胰岛细胞死亡的主要形式。Zumsteg等实验证实,一氧化氮(NO)合成和FAS/FAS特异性配体(FASL)的相互作用是CK致鼠胰岛细胞损伤的两个独立途径,且高浓度NO是CK致胰岛细胞损伤的终末效应因子。白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)单独或联用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)可诱导鼠或人胰岛细胞诱生型NO合成酶(iNOS)基因转录,催化NO合成,最终导致胰岛细胞损伤。环磷酸腺苷(cAMP)被普遍认为是胰岛素(insulin,Ins)分泌的一个重要放大器,那些通过刺激腺苷酸环化酶或抑制cAMP磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)的药物可极大的增加葡萄糖诱导的Ins分泌。目前将cAMP PDEs分为PDE_1~PDE_(11)共11类,国外实验已证实胰岛细胞同时表达PDE_3和PDE_4,但此两型抑制剂对抑制胰岛细胞NO的合成,升高cAMP水平还没有深入的研究。本实验将采用离体培养的雄性Wistar大鼠胰岛细胞,进一步研究IL-1β对胰岛细胞的损伤作用及特异性Ⅲ型PDE抑制剂(西洛酰胺,Cilostamide,CIL)、特异性Ⅳ型PDE抑制剂(咯利普兰,Rolipram,ROL)对胰岛细胞的防护作用及其机制。实验材料一、药品与试剂(1)IL-1β、CIL、ROL购自上海康成生物工程有限公司;(2)Ⅴ型胶原酶、NO试剂盒、胰岛素放免分析药盒购自北京邦定泰克生物技术有限公司;(3)’251一cAMP放免试剂盒购自上海中医药大学同位素室;(4)RPMI一1640培养液购自郑州华美生物制品有限公司;(5)胎牛血清白蛋白、四哇盐(M竹)、二甲基亚矾(DMSO)为sigrna公司产品(细胞生物教研室惠赠)。二、实验动物Wistar雄性大鼠购自中国医科大学动物实验中心。三、实验仪器相差显微镜、超净台、二氧化碳培养箱、滤器、细胞计数板、分光光度仪(日本岛津UV 160)等。实验方法1.胰岛细胞的分离及培养:雄性Wistar大鼠,体重100一1509,于无菌条件下取出胰腺,洗净剪碎用Hanks液充分漂洗后,置于含有1 .0群LV型胶原酶的Hanks液中,38℃水浴静止消化23而n左右。小心弃去上层胶原酶溶液,迅速加人等量含1.鲍几胎牛血清白蛋白的4℃RpMI一1640培养液清洗两次,离心去上清后加人Hanks液用吸管吹打成细砂样,80目不锈钢筛网过滤。收集胰岛细胞团滤液,100 xg离心10分钟后收集胰岛细胞团,加人含10%胎牛血清、2岁L葡萄糖、looIU/而青霉素、100m扩耐链霉素的RPMI一1640培养液后移入100而玻璃培养瓶中,置37℃、5%CO:的二氧化碳培养箱中,隔天换液,培养96小时后胰岛细胞团基本分离成良好的单个胰岛细胞。100 xg离心10分钟收集胰岛细胞,制成细胞浓度为6.5 x 105/耐的胰岛细胞悬液后移人24孔培养板中,每孔胰岛细胞数为6.5 x 105。2.细胞分组及测定方法:将上述胰岛细胞分为以下九组(每组n二5):(l)正常组(2)30U/rnllL一lp组(3)30U/InllL一lp、200nunoULCIL组(4)30U/InllL一lp、400mmol/LCIL组(5)30U/成L一lp、600mmol/比IL组(6)30U/InllL一lp、sonunoFLROL组(7)3OU/rnllL一lp、100nunoFLROL组(8)3OU/tnllL一lp、200nunol/LROL组(9)30U/恤L一lp、200nunoFLCIL、50Inlnol/LROL组上述各组胰岛细胞培养24小时后,分别取上清液lood进行以下实验NO测定:通过分光光度法测定上清液NO代谢产物亚硝酸盐累积量来反映一定时间内NO的合成量。cAMP水平测定:采用‘气一CAMP放免试剂盒测定上清液中CAMP含量。Ins测定:采用放免法测定Ins含量。细胞增殖活性测定:采用M,IT比色法。3.统计学处理:采用SPSS 11 .0统计软件包,单因素方差分析及线性回归,t检验分析。实验结果1 .IL一lp(30U/耐)能显著增加离体培养的雄性Wistar大鼠胰岛细胞的NO合成(P<0.01),同时对cAMP水平,Ins分泌及MTr值具有显著抑制作用(P值均<0.01),如表l所示。2.不同浓度CIL均能显著抑制IL一lp诱导的离体雄性Wistar大鼠胰岛细胞的NO合成的增加及cAMP水平的下降,如表1所示,较高浓度CIL(600mm亦L)能显著增加hs分泌并升高M,I’r值(P值均<0.01),且随CIL浓度升高,对胰岛细胞NO合成的抑制作用逐渐增强,应用线性回归,t检验分析提示CIL抑制NO合成具有显著剂量依赖性(R,二0.44,p<0.01),如图l所示。3.ROL随浓度升高,对IL一lp诱导的离体雄性Wistar大鼠胰岛细胞NO合成的抑制作用逐渐增强,如表1所示,但ROL仅于较高浓度(200mm0FL)时对抑制ILlp诱导的离体雄性Wistar大鼠胰岛细胞的NO合成的增加及cAMP水平的下降、Ins分泌的减少及M竹值的降低具有显著差异性(P<0.01),且亦呈现出显著剂量依赖性(r二0.56,p<0.01),如图2……   
[关键词]:一氧化氮;白细胞介素-1β;特异性Ⅲ型磷酸二酯酶抑制剂;特异性Ⅳ型磷酸二酯酶抑制剂
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国医科大学2004年