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庆大霉素致豚鼠内耳前庭毛细胞凋亡及JNK信号途径活化

李巍

  前言庆大霉素内耳毒性作用包括对前庭和耳蜗两部分毒性,尤其对前庭损害更严重,其损伤内耳前庭毛细胞的具体作用机制还不十分清楚,相关研究已从细胞凋亡角度探索前庭毛细胞损伤机制,并证实庆大霉素损伤后的前庭毛细胞中可以观察到核固缩、染色质凝集、凋亡小体形成等细胞凋亡的显著特征;同时,丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)中的JNK信号途径也被发现在凋亡细胞的信号传导途径起着重要作用。本实验试通过前庭毛细胞铺片、DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡、免疫组化方法检测磷酸化的JNK(p-jnk),研究庆大霉素造成内耳前庭毛细胞的损伤特点及作用机制。材料与方法1.1 实验动物 耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠30只,体重250~300克,雌雄兼用。随机分成二组,每组15只;实验组庆大霉素100mg·kg~(-1)·d~(-1),腹腔注射,连续7天;对照组:生理盐水等量腹腔注射,连续7天。动物实验期间每天测体重以调整药量,第8天处死豚鼠。左耳做毛细胞铺片,右耳做取听泡作连续冰冻切片,行免疫荧光及免疫组织化学检测。1.2 毛细胞铺片标本制备 各组豚鼠麻醉状态下,快速断头处死,取左侧听泡,开放卵圆窗和圆窗,从半规管开窗灌注新鲜配制的0.5%硝酸银溶液2~3ml,用4%多聚甲醛溶液灌注并固定于该溶液中,自然光下曝光2~3小时,解剖显微镜下剥离,取半规管壶腹嵴光镜下观察,摄片。1.3 冰冻切片标本制备 取实验组和对照组右侧听泡,4%多聚甲醛溶液固定24小时,10%甲酸-甲酸钠脱钙一周(25℃)。30%蔗糖4℃过夜,行OCT包埋,恒冷箱切片机沿蜗轴平行方向行10μm厚连续切片并编号,单号码切片行TUNEL法染色,双号码切片行免疫组织化学染色,观察壶腹晴毛细胞。1 .4荧光显色检测凋亡TuNEL试剂盒、DAPI由Promeg。公司提供。冰冻切片干燥,4%多聚甲醛固定45分钟,0.2%Tritonx一100浸泡5分钟,加入T叮酶反应液于37’C反应60分钟,DAPI复染。封片,荧光显微镜下观察。采用DNasel降解的标本作为阳性对照,PBS代替TdT酶反应液的标本作为阴性对照。1.5免疫组织化学检测p一jnk抗体由cell singnal提供。ABc试剂盒,DAB显色剂由武汉博士德公司提供。冰冻切片干燥,过氧化物酶阻断,室温孵育10分钟,滴加正常山羊血清,室温孵育20分钟,滴加一抗(兔抗鼠p一jnk多克隆抗体),4’C过夜。滴加二抗(生物素化羊抗兔工gG),室温孵育20分钟,滴加链霉素亲和素过氧化物酶溶液,37’C反应20分钟,DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片,显微镜下观察,摄片。阴性对照用PBS代替一抗,其余步骤不变。结果毛细胞铺片显示:实验组中可以看到毛细胞肿胀,结构混乱,排列不整齐;对照组中毛细胞排列规整,细胞间隔均匀,边界清楚,基本正常。荧光显色显示:实验组毛细胞核排列紊乱,发现了TuNEL染色阳性的、波长为520nlll的绿色荧光着色的细胞,位于壶腹晴顶端近上皮腔面的细胞层,从分布特点来看为前庭毛细胞,这也是被认为对庆大霉素药物毒性最敏感的部位,支持细胞层未发现TuNEL标记的阳性细胞;对照组中毛细胞核排列整齐,未见绿色荧光激发。免疫组织化学染色结果:实验组铺片显示有棕黄色颗粒沉淀在壶腹晴顶端,提示存在磷酸化的JNK免疫活性毛细胞,在底部、细胞排列较整齐的区域则没有观察到磷酸化的JNK免疫活性细胞;同样,免疫标记在对照组及阴性对照组中均呈阴性反应。荧光染色与免疫组化染色结果比较:在荧光染色阳性的对应切片标本组中,免疫组化染色显示有棕黄色颗粒沉淀。两组不同染色组切片相比较,染色阳性细胞位置基本一致,且均位于壶腹晴顶端,从分布特点来看为前庭毛细胞;荧光染色阴性的对应切片组中,则未见免疫染色阳性细胞。结论1.全身大剂量应用庆大霉素可以诱导内耳前庭毛细胞凋亡、损伤前庭毛细胞2.磷酸化的JNK在前庭毛细胞凋亡中起到了重要作用……   
[关键词]:庆大霉素;前庭;凋亡;JNK
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国医科大学2004年