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药物-蛋白结合作用的HPCE和HPLC法研究

周大炜

  本论文进行了平衡条件下测定药物-蛋白混合溶液中游离药物浓度的高效毛细管电泳和高效液相色谱分析方法研究。其目的是为新药研究和治疗药物监测中研究药物-蛋白结合作用提供简单、耐用、易操作和可行的方法。一、药物-蛋白结合作用的高效毛细管电泳法采用毛细管电泳-迎头分析法(CE-FA),以67mmol·L~(-1) pH 7.4的磷酸盐缓冲液为运行缓冲液,214nm下检测,测定了40μmol·L~(-1)人血清白蛋白与两个浓度水平的临床需监测药物达平衡后的混合液中药物的游离浓度。研究的药物包括:酮洛芬、茶碱、氯霉素、氧氟沙星、氯氮平和盐酸阿米替林,它们的化学结构、疏水性、生理pH条件下的电荷和电泳迁移行为各异。还应用此法研究了18-甲基炔诺酮对酮洛芬-人血清白蛋白结合作用的影响,结果发现18-甲基炔诺酮不能将酮洛芬从它的第一类结合位点上置换出来,而高浓度的18-甲基炔诺酮可将酮洛芬从它的第二类结合位点上置换出来。采用毛细管电泳-迎头分析模式首次测定了人血清白蛋白溶液、人血浆、兔血清和血浆中游离氯氮平的浓度。试样不经处理直接进样至未涂层毛细管。将游离氯氮平与内源性杂质有效分离的最优运行缓冲液为含1mmol·L~(-1) EDTA和0.5mol·L~(-1)甘氨酸的67mmol·L~(-1)磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。根据前沿峰的峰高直接测定游离氯氮平的浓度。方法与传统超滤法比较有很好的相关性。研究结果表明氯氮平与人血清白蛋白结合很少,但在人血浆、兔血清和血浆中有较强结合。此方法能够测定纳升级样品体积的多种平衡共存体系中游离药物的浓度,因而特别适合只能获得微少生物样品的蛋白结合作用研究。采用亲和毛细管电泳法(ACE),以20mmol·L~(-1) pH 7.4的磷酸盐缓冲液(含氨基乙酸0.5mol·L~(-1),EDTA 1mmol·L~(-1))为运行缓冲液,药物茶碱做运行缓冲液的添加剂,样品为含5%丙酮的30μmol·L~(-1)人血清白蛋白溶液,214nm下检测,测定了茶碱与人血清白蛋白的结合平衡常数,结果与文献值吻合得很好。采用毛细管电泳-配体分离法,测定了40μmol·L~(-1)人血清白蛋白与临床需监测药物达平衡后混合液中药物的游离浓度。毛细管两端施加的电压为负10kV,运行缓冲液为20mmol·L~(-1) pH 7.4的磷酸盐缓冲液(含氨基乙酸0.5mol·L~(-1),EDTA 1mmol·L~(-1)),其他条件同CE-FA法。测得的游离药物浓度与传统的超滤法吻合得很好。研究沈阳药科大学博士学位论文摘要旦旦旦口国里且鱼国旦口反旦且口口的药物包括:酮洛芬、盐酸丙米嗦、盐酸利多卡因、氯氮平和盐酸阿米替林。发现氯氮平和盐酸阿米替林几乎不与人血清白蛋白发生结合作用。本论文详细、深入地讨论了上述三种高效毛细管电泳模式的机理、优缺点及应用范围,由于不同模式得到的定性和定量信息的类型、应用条件和范围各异,通常根据被研究系统的本质来确定最优实验方法。二、药物一蛋白结合作用的高效液相色谱法采用高效液相色谱一迎头分析法,以67mmol.L一,印H7.4,I=0.17mol.L一‘)的等渗磷酸盐缓冲液为流动相,Pinkerton GFFn一55一80内表面反相柱(1 50‘4.6~,5娜)为固定相,214lun下检测,测定了系列浓度范围的酮洛芬、格列本脉和格列美脉与40脚ol.L一,人血清白蛋白结合作用的参数。通过非线性回归参数估算分别求得3个药物的结合参数。结果表明人血清白蛋白分子上3个药物的高低结合位点共存。采用超滤一高效液相色谱法测定了5个硫酞脉类药物与人血清白蛋白的结合作用,蛋白结合率由高到低的顺序为:格列美脉>格列本脉>格列齐特>格列哇酮>格列毗嚓。发现对于给定的系列非极性弱酸性化合物,蛋白结合率的高低与药物的疏水作用成正比。但毛细管电泳一迎头分析法的结果表明选定药物的疏水性和电泳迁移行为与其蛋白结合率的相关性不显著,影响药物一蛋白结合作用的因素有待深入研究。三、实验数据的后处理研究首次根据非线性回归最小误差平方法运行SAS中的“玛克低特”(MarquardtMethod)迭代法自编程序进行了药物一蛋白结合参数的估算,详细讨论了算法的基本原理和应用中需注意的事项。发现算法的选择,优良初始值的确定和对结果的评估三者决定了输出的结合参数是否为最优化值。……   
[关键词]:人血清白蛋白;高效毛细管电泳;非线性参数估算;高效液相-迎头分析;蛋白结合;血清和血浆
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:沈阳药科大学2003年