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生精细胞体外培养的研究

檀大羡

  本研究的目的是通过动物实验探讨生精细胞(spermatogenic cell)的分离方法、生精细胞体外培养过程中添加睾酮的浓度和与支持细胞(Sertoli cell)共同培养(coculture)的条件、生精细胞发育阶段的鉴定方法,以及精子细胞体外培养的条件,在此实验基础上研究人类生精细胞的体外培养,为解决无精子症(azoospermia)患者的治疗奠定理论基础和实验方法。本研究分动物实验和人类生精细胞培养两阶段进行。第一阶段动物实验包括五个实验内容。实验一探讨大鼠生精细胞分离的方法:采用研磨-Percoll法、单一酶-研磨-Percoll法、组合酶法(combination of enzymatic digestion)等三种方法分离睾丸组织,分别对分离出的细胞总数、分离所需的时间、活细胞率等项目进行比较。结果三种分离方法中以组合酶法得到的细胞总数最多、活细胞率最高、分离所需时间最短(P<0.05)。检测培养48h的分离的细胞存活率,结果用组合酶法制备的细胞的存活率比其他两种分离方法高(P<0.05),但培养过程中细胞死亡率比其他两组高,而在统计学上无显著性差异(P>0.05)。实验二生精细胞体外培养过程中添加不同浓度睾酮(testosterone,T)的研究:在培养液中添加睾酮,设T_0、T_1、T_2、T_3四组,添加睾酮的浓度分别为0ng/ml、340ng/ml、1700ng/ml、3400ng/ml,各组均加入卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)(50IU/L)。观察生精细胞体外培养的生长行为和培养前与培养后不同培养时间内细胞的存活率以及生精细胞的体外分化情况。结果生精细胞在体外培养过程中添加不同浓度的睾酮对细胞的存活率影响不大,但对细胞的分化和成熟有比较明显的影响,T_2组的生精细胞在体外培养中的生长状态较好,初级精母细胞分化为早期精子细胞的数量均比其他三组多(P<0.01)。实验三生精细胞与支持细胞共培养条件的研究:本实验在生精细胞与支持细胞共培养的基础上,设计三种不同的培养条件:第一组采用DMEM/F12作为基础培养液,添加其他成分;第二组在第一组条件的基础上,以非洲绿猴肾上皮细胞(Vero细胞)为饲养细胞;第三组采用改良人类输卵管液作为基础培养液并添加其他成分。通过观察在这三种不同培养条件下生精细胞体外共广西医科大学硕士学位论文生精细胞体外培养的研究培养的生长行为、培养前与培养后不同时间内细胞的存活率以及生精细胞体外分化情况,进行统计学分析比较。结果各实验组生精细胞均能从初级精母细胞阶段分化到精子细胞阶段,其中第二组生精细胞在体外培养中的生长状态、细胞存活率及初级精母细胞分化为精子细胞的数量均优于第一组和第三组(P<0.01);第二、第三组的精子细胞能进一步成熟到sbl、SbZ期精子细胞,但以第二组较好,在统计学上有显著性差异(P<0.01),第一组未见有SbZ期精子细胞生成。实验四生精细胞体外培养的鉴定方法:采用5一澳一2一脱氧尿昔(5一bromo一2-deoxyUridine,BRD功标记免疫细胞化学法和流式细胞分析(fl ow cytometry,FCM)两种检测技术。在实验前9天用BRDU注入大鼠腹腔,在体内标记大鼠生精细胞的DNA,通过免疫细胞化学法检测培养前的初级精母细胞,证实BRDU己在初级精母细胞中显示,培养4一6天后可观察到有BRDU标记的次级精母细胞,8一12天有BRDU标记的圆形精子细胞出现.FCM检测生精细胞培养前后倍体的变化结果显示,培养后单倍体精子细胞峰值较培养前增高。实验五精子细胞体外培养的研究:将精子细胞置于四种不同的条件下进行培养,观察精子细胞在培养过程中的生长行为及其成熟情况。结果在有Vero细胞饲养条件下培养,精子细胞与支持细胞共培养组和精子细胞单独培养组的生长状态较好,精子细胞的成熟率分别为(6 .54士1 .71)%和(3 .25士0.50)%,均高于单纯用改良人类输卵管液条件下精子细胞与支持细胞共培养和单独培养的成熟率伊<0.05)o第二阶段人类生精细胞体外培养的初步研究:以改良人类输卵管液或DMEMIF 12(以vero细胞为饲养细胞)为基础培养液,将4例患者的辜丸组织分离成生精细胞混悬液,用生精细胞与支持细胞共培养或分选出初级精母细胞和精子细胞单独培养,观察培养前后生精细胞的分化、成熟情况。结果显示:4例患者辜丸生精细胞经体外培养后均有不同程度的分化和成熟,初级精母细胞能分化为精子细胞,分化率平均为0 .47%一1 .50%;Sa期精子细胞能进一步变形、成熟为Sb、sc期精子细胞,成熟率为0.93%~5 .72%。通过以上实验研究,得出如下结论:①在攀丸组织的分离方法中,用组合酶法能在较短时间内获得数量较多的、比较纯化和存活率较高的各级生精细胞和支持细胞;②生精细胞培养过程中添加辜酮的浓度为1700ngl而时比较合适;③在生精细胞与支持细胞共培养过程中以砚m细胞为饲养细胞能为生广西医科大学硕士学位论文生精细胞体外培养的研究精细胞的生长和分化提供更好的培养条件,改良人类输卵管液比DMEM邓12培养液更适合生精细胞的体外成熟;④BRDU标记及FCM检测能比较准确地反映生精细胞在体外培养过程中从初级精母细胞阶段分化到精子细胞阶段的分化情况;⑤早期精子细胞经体?……   
[关键词]:生精细胞;支持细胞;共培养;无精子症
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:广西医科大学2004年