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家蝇抗菌肽分离纯化抗菌活性及分子结构研究

周义文

  抗菌肽(antibacterial peptides)是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的多肽,广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内。它除有非特异性的抗细菌、真菌、病毒等病原体外,还有抗肿瘤细胞的作用。特别是对多重耐药菌和肿瘤细胞有杀伤作用,而不破坏人体的正常细胞,是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药,是目前抗病原微生物药物开发研究中的一个热点。蝇及幼虫主要生长在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣环境中,其体表带有许多病原菌,能传播多种疾病。但其自身却不会因为感染病原菌而引起死亡,这说明蝇应该对病原微生物有强大的免疫力,并能产生强效抗菌物质。对家蝇资源的利用国外已投巨资作为高科技产业进行开发。家蝇在我国分布广,资源丰富,容易养殖,成本低,在医药开发方面是一个很好的资源。家蝇抗菌肽进行分离纯化没有现成的方法,需要建立一套合适方法逐级筛选未知活性肽,该项工作探索性强、工作量大。 金项目:本课题获重庆医科大学科研基金资助(20031230)本研究建立了家蝇及家蝇幼虫养殖方法,通过损伤感染免疫诱导的方法使家蝇及幼虫分泌抗菌活性肽。经过反复实验,用高速离心分级沉淀技术、高速离心超滤技术、Sephadex分子筛过滤层析技术和RP-HPLC等分离纯化出具有广谱高效的天然抗菌肽,并对其抗菌活性、抗菌谱和分子结构进行了初步研究和鉴定,为开发利用家蝇抗菌肽、克隆cDNA以及分子表达提供一定前期基础。家蝇及幼虫养殖方法建立家蝇及幼虫养殖是提取抗菌肽的前提条件,经过反复试验建立了较为稳定的养殖方法。家蝇正常生长,室内温度需保持在250C~280C,湿度为60%~70%,及一定的光照时间。幼虫养殖要保持正常的换气,充足的养料,60%~70%的湿度和适当的光照。2. 家蝇抗菌肽的分离纯化将免疫诱导的家蝇及幼虫和液氮一起研磨成粉末,以1g组织加10ml缓冲液(0.1 mol/L pH6.8 Tris–HCl, containing 2.0 mmol/L EDTA, 0.86 mmol/L PMSF)的比例在低温下制成匀浆,50 000g离心60 min,除去大分子蛋白质及组织残渣。再利用Sephadex G50和Sephadex G25不同的分子筛作用,分级分离不同的蛋白组分。由于肽具有极性,用M52阳离子交换色谱鉴定抗菌肽的极性,并用RP-HPLC进一步对抗菌肽进行分离纯化。经Sephadex G50过滤色谱分析,分步收集31杯不同组分,经抗菌活性粗筛,第15~19杯组分有抗菌活性(保留时间75 min~100 min),其中第17杯组分(保留时间85 min~90 min)抗菌活性较强。该抗菌活性组分进一步用Sephadex G25色谱分析,分步收集27杯不同组分,第15、16杯组分(保留时间95 min~105 min)抗菌活性较强。Sephadex G50色谱收集的抗菌活性样品经CM52阳离子交换色谱分析,共收集11杯组分,第5、6杯组分(保留时间50 min~70 min)有抗菌活性,说明得到的抗菌活性肽是阳离子肽。Sephadex G25色谱收集的抗菌活性组分经半制备和分析RP-HPLC分别进一步分离纯化,获得一具有抗菌活性的色谱纯抗菌肽,再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),电泳图谱证实为单一的蛋白质条带,分子量约9.0 ku。将其暂命名为家蝇抗菌肽1。3. 抗菌肽的抗菌活性研究及抗菌机制探讨用微量法和纸片琼脂扩散法测定了抗菌肽的抗菌活性,实验结果表明,纯化的家蝇抗菌肽具有广谱抗菌活性,对耐氨苄青霉素的阴性杆菌和阳性球菌均有明显的抗菌作用,对白假丝酵母菌也有一定的抗菌活性。用微量稀释法分别测定了纯化的抗菌肽和氨苄青霉素对标准菌株和临床标本分离菌株的最低抑菌浓度MIC(μmol/L),抗菌肽对三种标准菌株大肠埃希氏菌、铜绿色假单胞菌和金黄色葡萄球菌的MIC(μmol/L)分别为2.22、3.33和3.89,氨苄青霉素的MIC(μmol/L)则分别为10.77、>86.16和2.69;抗菌肽对11种临床标本分离菌株铜绿色假单胞菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌、普通变形杆菌、异形枸橼酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、福氏痢疾杆菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和白假丝酵母菌的MIC(μmol/L)分别为:3.89、2.22、4.44、6.67、3.33、6.67、5.0、6.67、4.44、4.44和13.33,氨苄青霉素则分别为>86.16、43.08、21.54、86.16、43.08、86.16、43.08、21.54、>86.16、>86.16和(-)。家蝇抗菌肽的表达可受病原菌的免疫诱导,通过皮肤损伤感染细菌后抗菌肽的生成量明显高于未诱导组,而且这种免疫诱导是非特异性的。每张药敏纸片加半纯品抗菌肽13.4μg时,未诱导组对大肠埃希氏菌的抑菌环直径为12mm,诱导组对大肠埃希氏菌的抑菌环直径为17mm。不同诱导菌诱导家蝇产生的抗菌肽半纯品分别做平板抗菌试验,每张纸片加Sephadex G25层析收集的半纯品抗菌肽20μg。大肠埃希氏菌诱导产生的抗菌肽对大肠埃希氏菌、铜绿色假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌环直径分别是20、15和14mm;铜绿色假单胞菌诱导产生的抗菌肽对上述三种菌的抑菌环直径依次是18、14和15mm;金黄色葡萄球菌诱导产生的抗菌肽对上述三种菌的抑菌环直径依次是18、14和15mm。结果显示不同细菌诱导产生的抗菌肽的抗菌活性无明显性差异。大肠埃希氏菌在5.6……