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鲢鱼背肌组织蛋白酶B、L的纯化鉴定及水解肌球蛋白的研究

李树红

  我国淡水鲢鱼(Hypophthalmihthys molitrix)资源丰富,充分开发和利用鲢鱼资源十分必要。以鲢鱼白肌为原料,生产鱼糜制品前景看好。但是鲢鱼是一种难凝胶化,尤其是易发生热(50—70℃)诱导鱼糜凝胶软化的鱼种。根据相关报道此现象与鱼类肌肉中的内源热稳定组织蛋白酶B、H、L水解鱼糜凝胶结构的主要成分——肌球蛋白有关。但是鲢鱼的内源组织蛋白酶B、H、L与热诱导鱼糜凝胶软化的关系目前尚不清楚。因此,本实验首先测定了漂洗前后鲢鱼肉糜中组织蛋白酶B、H、L活性的残留情况,并通过电泳分析了有无E-64(半胱氨酸蛋白酶的专一不可逆抑制剂)、PMSF(丝氨酸蛋白酶抑制剂)存在下,鲢鱼肌原纤维蛋白自溶(pH6.5,50℃)过程中,肌球蛋白重链相对含量降低的程度,从而初步判断是否存在组织蛋白酶参与热诱导鱼糜凝胶软化的可能性。然后采用直接的研究方式,即用纯化的热稳定组织蛋白酶B、L水解鱼糜凝胶结构的主要成分——肌球蛋白,从生物化学的角度阐明了鲢鱼组织蛋白酶B、L与热诱导鱼糜凝胶软化之间的本质关系,并同时为阐明难凝胶化的原因提供参考依据。漂洗实验表明漂洗后的鲢鱼肉糜中残留了组织蛋白酶B、H、L活性,其中组织蛋白酶L的残留活性和残留率都最高。因此,在鲢鱼鱼糜制品的加工过程中存在组织蛋白酶参与热诱导鱼糜凝胶软化的可能性。有无E-64、PMSF存在下,鲢鱼肌原纤维蛋白的自溶结果表明,不添加E-64的对照组中肌球蛋白重链相对含量下降了,而且其变化规律和肌原纤维蛋白中残留的组织蛋白酶的变化趋势基本吻合,添加E-64后,肌球蛋白重链的自溶被部分抑制,同时添加E-64和PMSF后,肌球蛋白重链仍旧发生了自溶,但是自溶程度进一步被抑制。上述结果说明鲢鱼肌肉中的溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶在鱼糜蛋白自溶中起到一定的作用,而且组织蛋白酶L可能是更重要的鱼糜蛋白水解酶,同时鲢鱼肌原纤维蛋白上还可能结合着能够引起自身水解的其它类型的凝胶软化诱导蛋白酶。本实验首次从鲢鱼背部白肌中纯化了两类四种组织蛋白酶活性部分,即L1、L2、B1、B2,并对其中两个主要组织蛋白酶活性成分B2、L2的基本理化性质和生物学活性特征进行了鉴定,结果表明这两个酶就是溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶B和L。但是它们在肌体内都是以高分子量的“前体”或“中间体”形式与低分子量的成熟单体形式共存的。向鲢鱼肌球蛋白中分别添加相同量(以活性单位计算)的纯化的组织蛋白酶B(B2)和组织蛋白酶L(L2),然后分别在pH6.5,35℃、50℃或60℃的条件(此条件是依据鲢鱼鱼糜的pH (6.5-7.5)和加工中凝胶化温度(40℃以下)及凝胶软化温度(50℃以上)设计的)下进行水解反应。然后通过电泳分析,结果表明,尽管在上述水解条件下,组织蛋白酶B和L都能水解鲢鱼肌球蛋白重链,但是组织蛋白酶L水解鲢鱼肌球蛋白重链的程度明显高于组织蛋白酶B。尤其当水解反应在偏酸性环境下(pH5.0-5.5)进行时,组织蛋白酶L水解肌球蛋白重链的速度明显增加,而组织蛋白酶B仍旧轻微水解肌球蛋白重链。因此,组织蛋白酶L是一种更重要的鱼糜蛋白水解鱼酶,在鲢鱼鱼糜热诱导凝胶软化中起到了关键性的作用。组织蛋白酶L能够在低温环境下水解肌球蛋白重链,因此,组织蛋白酶L的蛋白水解活性可能是难凝胶化的一个原因。……   
[关键词]:鲢鱼;组织蛋白酶L;组织蛋白酶B;纯化鉴定;热诱导鱼糜凝胶软化
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业大学2004年