手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

家蚕肠液AKP的遗传分析及野桑蚕AKP基因的克隆研究

罗英

  碱性磷酸酶广泛存在于各种生物体内,目前已从细菌、病菌、藻类、高等植物、昆虫、水生动物、哺乳动物和人等各种生物体内分离得到,并已通过多种方式应用到实际中,如医学、毒物学、核酸研究、免疫学、食品、化妆品及人、动物和植物许多疾病的检测等多个方面。对AKP的研究,目前已有许多报道,作为药用AKP,在韩国、日本等国已有产品,但国内却很少。由于目前AKP分离纯化的工艺比较复杂,同时还要受到酶源的限制,因此开发新的AKP来源显得尤为重要。家蚕是一种重要的经济昆虫,也是分子分子遗传学研究中重要的模式生物。AKP作为家蚕体内一种与其消化吸收、物质代谢和运输,以及其经济性状和生理状况密切相关的功能酶,已引起了国内外学者对其的广泛研究,但目前国内的研究主要集中于其理化性质、活性影响因素等基础理论研究上,而对于其活性的大规模调查及其遗传方式,却未见相关报道研究。国外虽然报道了从家蚕中肠内提纯的AKP的部分理化性质、动力学性质的研究结果,并克隆了AKP全基因,但到目前为止,尚未发现有关直接应用家蚕AKP方面的研究报道。本研究通过对西南农业大学家蚕基因库84个家蚕品种及遗传系统肠液AKP活性进行调查,发现某些家蚕品种具有极高的AKP活性,而这种家蚕AKP将有可能直接用于大规模生产,所以对其进行分离纯化,研究其性质和特点具有重要的研究价值。基于此种思考,本研究首先根据调查结果,筛选出AKP活性高的品种与活性低的品种进行杂交组合,分析了其遗传规律,然后进行了家蚕肠液AKP的分离纯化,对其基本理化性质及功能基团的特点进行研究。家蚕与野桑蚕的血缘亲近,野桑蚕作为丰富的野生蚕业资源,是可开放利用的宝贵基因库资源;同时也是研究家蚕分化起源的重要材料。迄今已对野桑蚕进行了广泛而深入的生物学上的研究、染色体的结构及变异研究、DNA多态性研究、在家蚕育种上的应用研究以及作为桑园害虫防治上的研究。但因其茧层薄,茧丝短,尽管目前对野桑蚕的研究已比较深入,但仍受到一定限制。近年来,随着分子生物学的发展,有关野桑蚕及家蚕的分子系统学研究也取得了一定的进展,对其基因水平的研究也相继开展,例如丝蛋白基因、核糖RNA基因的、一研究等,但是对于野桑蚕AKP基因的研究却末见报道·因此,本研究以野桑蚕为材料,根据GenBal水中己公布的家蚕AKP全基因序列,遵照特异引物设计原则,设计相应的引物,克隆了野桑蚕AKP基因的部分序列,并将其推定氮基酸、c渊A、DNA序列与家蚕及其它物种的相应序列进行比较分析,从而分析它们的关系及进化机制。现将研究结果分别报告如下:1.活性调查及遗传分析通过从P活性调查研究,结果表明家蚕从P活性是受多基因支配的,而且有主基因控制,同时发现了高AKP活性并可能有应用前景的品系。根据从P活性调查结果确定进行杂交组合和分离纯化的实验材料。在杂交组合的14区中随机取样,分别取每头蚕的消化液,然后侧酶活性,进行遗传分析,实脸结果表明:从P活性遗传方式具有显著的数t性状特征,在受到徽效多基因控制的同时也存在主基因的作用:其活性与家蚕性别有一定的关系,推侧认为在家蚕的性染色体上可能存在影响从P活性很强的基因。2.分离纯化对高活性品种的肠液AKp进行分离纯化,依次经过DEAEee琼脂糖柱层析,sePhacryls一200凝胶柱层析,然后将分离得到的从P透析、干燥,进行酶纯度鉴定,纯化的从P经等电点聚焦电泳和SDs一肠E均显示一条蛋白带,表明纯化的AKP蛋白质是均一的。最后纯化倍数为200.92,活性回收率为85.4外。3.性质研究将纯化的AKP样品经S璐一PAGE,侧得其亚基分子童为57950KD;经等电聚焦电泳测得其等电点为4.7;其最适PH为10.5,皿稳定范围为7一12;最适温度为60℃;以磷酸苯二钠为底物,侧得其如值为1.5画。1/L.用修饰剂PMSF、D竹、PCMB、玛略、BrAc、IAc、SUAN和侧璐选择修饰家蚕从P的儿种氨基酸残基,并测定酶活力变化,结果表明:价T、PQ.、TNBs、价Ac、IAc和sUAN的修饰能显著抑制酶的活力,活力的降低与修饰剂的浓度有关.四SF和NBS的修饰对酶的抑制作用影‘响较小。初步认为:疏基和组氨酸的咪哇墓可能是家蚕A即的活性必需功能基团,参与酶的催化作用;赖氨酸残基和二硫键与酶活力也有一定的关系,它们可能是维持酶特定构象的重要基团。效应物甲醉、乙醉、乙二醇、异丙醉对酶活力有不同程度的抑制,其抑制作用的大小顺序依次为:异丙醉>乙醉>甲醉>乙二醉。:4.肠液AKP的快速提取‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘-‘‘‘‘‘‘连‘J‘‘‘‘‘-‘‘‘‘二‘‘‘-‘通过反复试验,发现可以从家蚕体内快速提取肠液脚,且其活性不会受到影响。5.重庆野桑蚕从P基因部分序列的测定……   
[关键词]:AKP;遗传分析;分离纯化;功能基团;同源性分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南农业大学2004年