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载绿色荧光蛋白基因壳聚糖纳米粒载体的制备和转染的研究

李斌生

  目的:优化实验条件,制备合适的壳聚糖纳米粒,并连接上质粒,研究壳聚糖纳米粒对DNA的结合和保护能力,利用培养的HepG-2细胞进行转染,评估其转染性,比较壳聚糖纳米粒与阳离子脂质体的转染率。方法:以离子交联法制备壳聚糖纳米粒,并送激光微粒度仪及扫描电子显微镜检测,了解粒径的分布和形态;通过静电吸附作用连接上增强型绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C_1(报告基因);经琼脂糖凝胶电泳分析载体与DNA结合力,并通过紫外分光光度计检测其载药量和包埋率;通过DNase Ⅰ消化实验,检测壳聚糖纳米粒对DNA的保护作用;以阳离子脂质体为对照,利用培养的HepG-2细胞进行转染,通过荧光显微镜观察其基因转染的可行性并比较其转染效率。结果:1.微粒度仪及电镜检测证实壳聚糖纳米粒呈均匀分散的球形颗粒,最小粒径50nm,d(0.5):95nm。2.琼脂糖凝胶电泳结果显示壳聚糖纳米粒能有效结合增强型绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C_1紫外分光光度计检测不同比例结合(纳米粒:质粒)pEGFP-C_1质粒的壳聚糖纳米粒的包埋率分别为:100%(50:10),100%(50:25),100%(50:50),92%(50:75),69%(50:100)。3.DNase Ⅰ消化实验的结果显示:未加纳米粒及按5:50的比例加入纳米粒处理的,在凝胶上无明显的DNA条带;而按50:50,100:50的比例处理的,均显示明显的DNA条带,显示壳聚糖纳米粒在此种比例下有良好的DNA保护作用。4.荧光显微镜检测显示:用连接上pEGFP-C_1质粒的壳聚糖纳米粒30ul去转染时的转染率高于Lipofectamin的转染率,经统计有显著性差异。结论:制备了粒径较小、均一的壳聚糖纳米粒,壳聚糖纳米粒能有效连接上质粒,且对DNA有保护作用,并能转染HepG-2细胞,而且效率高于阳离子脂质体Lipofectamin。……   
[关键词]:壳聚糖;纳米粒;pEGFP-C_1质粒;脂质体;转染率
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中南大学2004年