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白果活性蛋白的分离、纯化、结构及其生物活性研究

黄文

  银杏资源以其显著的生物活性及药理作用而引起世界各国科学家的广泛关注。白果作为传统的中药材已有600多年的历史,但对其主要活性成分知之甚少。近年来,仅有少量研究表明白果具有延缓衰老、耐缺氧、抗疲劳和止咳平喘等功效。为探明白果中的活性成分,本文以白果蛋白为研究对象,采用现代分离技术和先进的分析测试手段及动物学实验方法首次从白果中提取、分离及鉴定了具有延缓衰老、抗氧化活性的新蛋白,并且对此蛋白进行了一级结构和空间结构的表征,主要结果如下:1.白果活性蛋白的提取、分离、纯化和鉴定根据不同地区白果的形状、颜色、口味、粒重等形态特征和白果中蛋白质、淀粉、脂肪、总酸、总酚、游离酚和类胡萝卜素等主要成分的含量,选用泰兴大佛指白果为原料进行研究。以脱脂白果为原料,采用盐溶和盐析的方法,首次从白果中制备出清蛋白(GAP)、球蛋白(GGP)和盐溶蛋白(GSP),并确定了适合白果活性蛋白提取制备的工艺。化学成分分析表明采取此工艺制得的GAP、GGP和GSP,其蛋白质纯度高,氨基酸组成丰富、合理,属于优质蛋白质。利用DEAE-Cellulose离子交换层析,采用分步式结合梯度式的洗脱模式成功地将清蛋白分成为两个级分(GAPⅠ和GAPⅡ)。采用DEAE-Sephadex-A50柱层析,进一步纯化GAPⅡ,得到较均一的GAPⅡa,分光光度法、层析法、电泳法和质谱法鉴定其为具有色谱纯和电泳纯的样品。结合肽质量指纹图谱和肽序列标签法用于蛋白质数据库搜索,搜索结果确认GAPⅡa为未知蛋白质,从而证实了GAPⅡa是本实验室从白果中分离出的一种新的具有延缓衰老和抗氧化活性的蛋白质。2.GAPⅡa结构表征采用MALDI-TOF-MS、ESI-MS分析新技术结合SDS-PAGE和常规PAGE等分析方法,测定了GAPⅡa的精确分子量、GAPⅡa所含两个肽链的分子量和它们的肽质量指纹图谱等。实验结果表明GAPⅡa的分子量为29248Da,是由两条分子量接近,氨基酸序列相似,相互间以二硫键连接的肽链组成。电泳糖蛋白染色、化学成分分析、MALDI-TOF-MS分子离子峰的半峰宽以及β-消除反应的实验结果进一步表明GAPⅡa在Ser或Thr残基上以O-糖苷键方式连接了少量的糖,为一种糖蛋白。采用ESI-MS/MS快速准确地测定了酶解肽段其中的肽段(2470)和肽段(1911)的氨基酸序列,即肽质量数为1910.9644Da的肽段是由17个氨基酸残基按序列Leu-Val-Gly-Asn-Thr-Ala-Asp-Leu-Gly-Asn-Trp-Gln-Ser-Met-His-Leu-Arg组成;肽质量数为2470.0044Da的肽段为23个氨基酸残基按序列Ala-Val-Val-Val-Asp-Ser-Asn-Thr-Gly-G1u-Thr-Trp-His-Cys-Gly-Glu-Gly-Met-Pro-Asp-Pro-Asn-Arg连接而成。这两个肽段共同存在于GAPⅡa的两条肽链中。华中农业大学2002届博士毕业论文园二色谱、红外光谱和拉曼光谱的分析结果显示GAP lla主要以p一折叠或卷曲结构为主,Q一螺旋结构含量较少,与采用ANTHEPROT4.3预测的结果一致。紫外差光谱和荧光光谱显示,在水溶液中GAPlla分子中的TrP残基两种类型都存在,既有暴露于分子外部的Trp残基,也有处于疏水内部的TrP残基。其溶液构象在pH7时最稳定,但酸碱度对其构象影响较小,在pH<7时GAP na构象相对变化略大于在碱性环境。有机溶剂对其构象变化影响较大。通过扫描电镜和透射电镜观察,GAPlla聚集态主要以大小不一的空心球状形式分布于其他如片层、针状和蜂窝状形式之间。X一射线衍射分析结果表明经冻干得到的GAP Ha粉末结晶度不高,但在结晶区其分子的规整性较高。利用荧光光谱和紫外差光谱研究GAP Ha在变性剂盐酸肌作用下,蛋白质分子伸展与抗氧化活性关系时发现,虽然GAPlla伸展度对活性有影响,但从GAPlla抗经基自由基活性变化来看,其影响是有限的。总的来说,GAPlla抗经基自由基的活性比较稳定,较少受到蛋白质变性的影响。3.白果蛋白的生物活性研究非脂质体系抗氧化实验、体外、体内抗生物氧化实验和果蝇生存寿命实验等结果表明白果蛋白具有良好的抗氧化性能和延缓衰老的作用。GAP、GGP、GAPI、GAPll和GAP Ha均能有效清除Fenton体系中的·OH和光照核黄素体系的02’一,并且其活性随着GAP lla含量的增加有所上升,以GAP na为最高。在体外给药反应体系中,GAP和GSP能显著地降低MDA生成和血和肝中过氧化物的含量,起到保护细胞膜和红血球的作用。通过饲喂,GAP和GSP显著地降低了小鼠体内MDA的生成,增强了机体SOD和GSH一PX活力。GAP还可以明显延长果蝇平均寿命及最高寿命。这些结果提示白果蛋白延缓衰老的作用机理与白果蛋白具有抗氧化作用有关。……   
[关键词]:白果蛋白;分离;纯化;结构;序列分析;MALDI-TOF-MS;ESI-MS/MS;生物活性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2002年