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甘蓝自交不亲和性引起的蛋白质磷酸化及其相关特征研究

吴能表

  自交不亲和在植物界中广泛存在,引起了植物学界和分子生物学界的广泛关注,它有利于植物的遗传进化,扩大变异程度,在育种上有较高的应用前景。研究证明,植物自交不亲和性由S位点决定,目前已分离出多种S-基因及其表达产物,在孢子体型自交不亲和植物中,已从芸薹属分离获得多种编码S-位点糖蛋白(S-locus glycoproteins,SLG)的雌蕊S-基因,如甘蓝SLG-2,SLG-22和SLG-29,白菜的SLG-8,SLG-9,SLG-10等。还从甘蓝中分离得到了编码S-受体激酶(S-receptor kinase,SRK)的雌蕊S基因。SLG和SRK可能与磷酸化和去磷酸化参与的某种信号传递有关,最终导致自身花粉生长受阻,但迄今为止尚未分离出SRK的底物,底物的分离对进一步弄清自交不亲和信号传导机制,具有十分重要的意义。本文以自交不亲和甘蓝(Brassica oleracea L.)为材料,全面研究了和探索性地阐述了自花授粉和异花授粉条件下蛋白质磷酸化作用及其相关生理生化特征,分离了授粉过程引起的磷酸化蛋白质和阻止自花花粉萌发的蛋白质,即SRK的底物,取得了如下富有新意的结果,这些结果分属于相互联系的5个方面:1.甘蓝自交不亲和花粉萌发及其与蛋白质磷酸化的关系探讨通过在柱头提取液中添加正磷酸、ATP、CaCl_2和槲皮素分别探讨了它们对花粉萌发和花粉管生长的影响,以及蛋白激酶在阻止自花花粉萌发中的作用,分析了花粉萌发与蛋白质磷酸化的关系。结果表明,ATP、CaCl_2以及ATP+Na_3PO_4处理使自花花粉萌发率显著降低,花粉管生长明显减缓;促进异花花粉萌发和花粉管的生长。槲皮素处理能极大地提高自花花粉萌发率和花粉管的相对长度,而对异花柱头提取液诱导花粉萌发和花粉管的相对长度几乎没有影响,因此SRK激酶对于自交不亲和的实现是必需的。2.自交不亲和甘蓝授粉引发花柱部分生理生化变化及其与蛋白激酶抑制剂的关系研究研究了自花授粉和异花授粉后自交不亲和甘蓝花柱内的酶保护系统的动态变化。结果表明,授粉引起花柱内500、POD和cAT活性上升,提高了酶保护系统的保护能力;而异花授粉引起的三种酶的活性上升超过了自花授粉。从SOD、POD和CAI,的构成比例来看,授粉引起SOD和CAT活性相对降低,而POD活性相对升高,这在自花授粉中表现得更为明显。利用灰化技术和原子吸收方法,对甘蓝授粉过程中花柱内K+和c扩十含量动态变化进行了探讨。结果发现,SI甘蓝无论是自花授粉还是异花授粉,授粉后K+含量呈下降趋势,在授粉后O一lh自花授粉引起的K+含量下降较异花授粉快;授粉后3h和6h时,自花授粉和异花授粉之间K十含量都分别存在极显著差异。无论自花授粉还是异花授粉,授粉后。一1 hc扩十含量都迅速降低,且降低幅度随授粉时间的延长而减小。授粉后0.5h和lh时自花授粉与异花授粉花柱内c扩+含量分别存在显著性差异,授粉后较短时间内花柱内c扩+含量与授粉亲和与否存在明显相关性。用蛋白激酶抑制剂处理,探讨了花柱内soD、PoD、cAT活性及K十、c扩十含量与蛋白激酶的关系。对自花授粉而言,3种酶的活性都因抑制剂的加入而升高,K+、c扩十含量略有降低;异花授粉却引起所有指标都略有降低。抑制剂处理后实际就是阻止自花授粉萌发的蛋白质磷酸化受阻,阻止自花花粉萌发的机制在很大程度上被阻断,因而自花授粉后可以引起花粉萌发,异花授粉指标略有降低,原因可能在于植物体内蛋白激酶并不单一,在不同时期和不同的生理过程中虽然某种或几种激酶占主要部分,起主要作用,但仍有其它激酶的存在,而榭皮素这类抑制剂并不是专门抑制某种激酶的抑制剂,它可能抑制多种激酶的活性,所以也就抑制了体内其它反应激酶的活性,导致酶活和离子浓度的改变。通过对花柱内蛋白含量测定表明,自交不亲和材料的异花授粉和自花授粉后短时间内花柱的蛋白质含量,都呈现出先上升再略微下降,并迅速维持在较高的含量水平,自花授粉后5min时达到峰值,异花授粉峰值不十分明显,且出现时间在授粉后10 min,晚于自花授粉,在10 min以上自花授粉和异花授粉蛋白质含量几乎一致。3.授粉与Caz+定位关系研究采用透射电镜观察技术手段和c扩十化学定位技术,分析了自花授粉与异花授粉前后c扩十在柱头表皮细胞中的分布情况以及蛋白激酶抑制剂对自花授粉后c矿十的分布的影响。结果表明,未授粉前甘蓝柱头表面细胞内c扩+定位分布的焦锑酸钙沉淀颗粒大量出现在质膜、内质网,细胞核中也有一定分布,液泡中较少。自花授粉3h后,焦锑酸钙沉淀颗粒主要分布在中央大液泡及其膜上,颗粒粒度较大,分布密度高,胞质中极少;异花授粉后,液泡内极少见,但在细胞核、胞质中有较多分布。说明授粉会引起c扩十的重新分布,且这种分布与c扩十授粉亲和与否有密切的关系,不亲和授粉会引起ca2+在液泡中的大量存在,亲和授粉则不出现。通过激酶抑制剂处理后,再进行自花授粉,c扩十在细胞内的分布与异花授粉几乎一致,说明蛋白激酶促使了c扩十的重新分布,这种分布客观上表现出自交不亲和,这为……   
[关键词]:甘蓝;自交不亲和;Ca~(2+)定位;蛋白激酶活性;蛋白质磷酸化
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西南农业大学2003年