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安定单克隆抗体的研制(一)

孙俊红

  目的(1)比较两种合成安定衍生物的方法,建立一种新的安定抗原性BSA(Bovine Serum Albumin)结合物的合成途径,为同类型小分子抗原的抗原性BSA结合物合成提供新的技术路线;(2)制备抗安定的多克隆抗体,采用ELISA法检测所合成安定抗原性BSA结合物的免疫原性和反应原性,为制备单克隆抗体提供可靠的筛选方法;(3)免疫组织化学法检测安定中毒大鼠脑组织中安定,为安定或其它小分子物质的检测提供新的方法。方法(1)安定抗原性BSA结合物的制备利用有机合成方法分别采用戊二酸酐和1,3-二氯丙烷在安定的3位碳原子上连接可以与蛋白质相结合的5-羰基戊酸基或1-氯丙烷基,合成安定衍生物。薄层层析和柱层析分离合成产物,薄层色谱扫描法、傅立叶红外分光光度分析和超导核磁共振分析鉴定衍生物结构和稳定性;根据胺的制备原理将安定卤代烃衍生物与载山西反科大学20仍年硕士研究生毕业论文体蛋白BSA上天冬酞胺(AsparagineN)、谷氨酞胺(GlutamineQ)、精氨酸(ArginineR)和赖氨酸(LysineK)的游离氨基发生亲核取代反应,制备出安定抗原性BSA结合物。紫外分光光度法和SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳的方法比较安定抗原性BSA结合物和BSA的紫外吸收峰和分子量。(2)安定多克隆抗体的制备背部皮内多点注射安定抗原性BSA结合物和F盯end’s完全佐剂混合物初次免疫新西兰大白兔,第21、28、35、42、49、56天安定抗原性BSA结合物和Furend’s不完全佐剂混合物同样方式加强免疫,第60天采血,收集血清。BSA吸收后,采用ELISA法比较空白组、实验对照组、实验组和阳性对照组血清的OD值,鉴定抗体的特异性;对半稀释法测定抗血清效价。(3)脑组织中安定的免疫组织化学测定安定片粉末灌胃,复制Wistar大鼠安定中毒模型,取大脑福尔马林固定,石蜡包埋切片。以BSA吸收的多克隆抗血清为一抗进行SABC免疫组织化学染色,分析。结果(1)利用安定和戊二酸配、1,3一二氯丙烷均合成得到安定3位5一拨基戊酸基和1一氯丙烷基取代的衍生物。傅立叶红外和超导核磁共振分析证明其分子结构与设计一致。常温或暴露于光线下时,戊二酸醉衍生物容易分解,卤代烃衍生物不山西民料大学2003年硕士研究生毕业论文分解。安定抗原性BSA结合物的紫外吸收特征峰较BSA发生红移、SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳的迁移速率与BSA差异明显。(2)安定抗原性BSA结合物免疫新西兰大白兔,得到抗安定血清。抗体特异性测定显示,空白组和实验对照组的OD值间无显著性差异,与其相比,实验组和阳性对照组OD值均显著升高;与实验组相比,阳性对照组OD值显著升高;与实验对照组相比,实验组OD值显著升高。抗血清的效价达到1:2560。(3)SABC染色,安定中毒大鼠大脑组织细胞膜和核膜上可见褐色颗粒沉着,对照组未见褐色颗粒沉着。结论采用卤代烃作为桥连剂,合成安定的卤代烃衍生物,进一步交联于载体蛋白的技术路线适用于安定完全抗原的合成;本实验合成的安定完全抗原可以刺激机体产生抗安定抗体,但抗体特异性和血清效价有待于进一步提高,抗体类别有待于进一步鉴定;本实验所建立的ELISA法为安定单克隆抗体制备提供了可靠的筛选方法;免疫组织化学法可应用于富尔马林固定检材内安定的定性检验。……   
[关键词]:安定;抗体;抗原性BSA结合物;1;3-二氯丙烷;戊二酸酐
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山西医科大学2003年