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草乌标准提取物的研究

黄建明

  草乌为毛茛科植物北乌头Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥块根,味辛性温,有大毒,具有祛风湿、止痛的功效,用于风寒湿痹,关节疼痛,心腹冷痛,麻醉止痛等。草乌应用较多,但各地药材质量、炮制方法和质控水平不一,使其质量差别较大,造成了不少中毒事件。因此,制备“安全、有效、可控”的草乌标准提取物及其制剂十分必要。为此,本文从质量控制、提纯工艺、乌头碱(aconitine)的水解动力学、制剂、毒性和药效等五个方面对草乌标准提取物进行了研究。同时,对不同来源的草乌和川乌(乌头A. carmichaeli Debx.的块根)生药及其标准提取物进行了质量比较。对草乌中乌头类生物碱的含量测定方法进行了研究。选用容量法或酸性染料比色法测定总生物碱的含量:容量法采用《中国药典》2000版一部中的硫酸回滴法,将甲基红指示剂改为甲基红—溴甲酚绿混合指示剂,使终点颜色变化更为明显, 结果的重现性良好。酸性染料比色法选择溴甲酚绿法。两法对草乌和川乌生药样品的测定结果基本一致,其中以酸性染料比色法的灵敏度较高。采用异羟肟酸铁比色法测定了酯型总生物碱的含量。建立了准确、灵敏的HPLC法测定三种双酯型生物碱[乌头碱(aconitine)、次乌头碱(hypaconitine)和新乌头碱(mesaconitine)]的含量。确定了HPLC指纹图谱的测定方法。应用以上各法对不同来源的草乌及川乌进行了测定。结果表明,生药的基源植物、产地来源及炮制与否是影响生物碱含量及HPLC指纹图谱相似程度的重要因素。本文所建立的分析方法及对已有方法的改进可供国家药典委员会参考。采用正交设计等方法对草乌标准提取物的初提、壳聚糖絮凝和大孔树脂提纯等工艺进行优化,确定了稳定可行的工艺路线。应用该工艺制得的11批草乌标准提取物中,总生物碱的含量均较高(平均含量达94.18%),三种双酯型生物碱的含量及比例稳定,且HPLC指纹图谱的重现性好。此外,还制备了不同来源的草乌及川乌标准提取物。结果显示,生药来源是导致标准提取物生物碱含量差异的主要因素之一。该提纯工艺有利于减小总生物碱的含量差异,可使HPLC指纹图谱的相似度在总体上有一定的提高,但对三种双酯型生物碱含量差异的改善程度不大。因此,固定基源植物和产地来源,采用重现性好的提取工艺是保证标准提取物质量稳定、可靠的重要因素。在乌头碱水解机制的研究中发现,乌头碱的一级水解产物中除了苯甲酰乌头碱(benzoylaconine)外,尚有一分子量为585的化合物,可能为焦乌头碱(pyraconitine或16-epi-pyraconitine)。采用HPLC-UV法研究了乌头碱的水解动力学,并借用药代动力学的方法求算出一级和二级水解反应的表观速率常数。结果表明:乌头碱在pH2.0~7.0的范围内,其反应机制为碱催化的水解反应。乌头碱的降解速率受温度和pH的影响较大,在pH2~4时,降解速率很小,乌头碱较稳定;随着温度和pH值的升高,乌头碱的降解加快,尤其当pH>5时,降解速率显著增大。此外,根据Arrhenius方程,计算出各pH值下25℃时的一级水解速率常数和t0.9,为乌头碱的稳定性研究提供了重要的实验依据。首次应用现代透皮理论研究了草乌及其标准提取物的透皮特性,并在此基础上研制了新型的凝胶剂与透皮贴片。鉴于草乌中乌头类生物碱的经皮渗透性很差,因此在透皮特性的研究中重点考察了促透剂的影响。结果发现:乙醇、氮酮、油酸、肉豆蔻酸异丙酯和桉油均可促进乌头类生物碱的透皮吸收,乙醇与其它促透剂间有协同作用,其中乙醇合用桉油为较理想的促透剂组合。草乌标准提取物凝胶剂以卡波姆为基质,具有释药速率快、均匀细腻和涂布舒适等优点。草乌标准提取物贴剂为膜控释型贴剂,以卡波姆凝胶为贮库,乙烯-醋酸乙烯共聚物薄膜为控释膜,硅酮压敏胶为粘贴层。该贴剂的粘帖性能良好,可在48小时内维持恒定的透皮速率。急性毒性和镇痛实验的结果表明:草乌标准提取物溶液剂灌胃给药和凝胶剂经皮给药均有良好的镇痛效果。但前者的LD50与镇痛作用的起效量仅相差5倍左右,而凝胶剂在最大给药量(80mg/kg)时,仍未发生死亡现象,与起效量相差128倍,说明凝胶剂的安全性显著高于溶液剂。因此,以草乌标准提取物为原料的外用凝胶剂具有深入研究开发的价值。对所制得的草乌标准提取物透皮贴剂也将继续进行毒理学和药效学的研究,为进一步开发产品奠定基础。……