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鹅源新城疫病毒ZJ1株全基因组序列的测定及含该毒株全基因组cDNA的转录载体的构建

黄勇

  新城疫病毒(NDV)是最重要的动物病原体之一,可感染多种禽类造成严重疾病。到目前为止,NDV的B1、Lasota、Clone-30、Beaudette C、HB V4等毒株的全基因序列已在GenBank上公布,其长度均为15186nt。NDV基因组全长序列的测定导致该病毒反向遗传学的诞生,为基因组各基因结构和功能研究以及新疫苗的研制开辟了新的道路。自1997年以来,在我国的华东及华南一些地区中出现由新城疫强毒所致的鹅的严重临床疾病,引起从业者和研究者的广泛注意,因为鹅以往被认为是对NDV不敏感的禽类。本研究对一个NDV鹅源2000年分离株(ZJ1)进行了全基因组序列测定,发现它的基因组全长为15192nt,比上述已报道的5个毒株的基因组全长多了6个核苷酸。我们确定了该6核苷酸的位置,并对其它具有不同遗传及流行病学背景的17个NDV毒株是否在基因组的相同位置多6个核苷酸进行了研究。本文还构建了一个含该毒株(ZJ1)全基因组cDNA的转录载体和3个表达质粒。1 鹅源新城疫病毒ZJ1株全基因组序列测定及比较分析依据GenBank上公布的NDV的基因序列,寻找各新城疫病毒同一基因之间核酸序列同源性比较高的区域。依据这些区域设计9对引物,使相邻引物对扩增的片段之间有部分核酸序列重叠区,然后通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)用9对引物扩增出覆盖除基因组末端序列之外的全部基因组内部序列。病毒RNA的5′及3′端的序列由T4RNA酶介导的cDNA末端快速扩增技术获取。将获取的覆盖整个病毒基因组的序列进行组装后发现,NDV ZJ1株的全基因组核酸序列由15192个碱基组成,比已在GenBank上公布的Beaudette C、B1、Lasota、Clone-30和HBV_4 5个NDV毒株的全基因组序列多6个核苷酸基序,它位于核衣壳蛋白基因的5′端非编码区内,相当于其它5个NDV毒株全基因序列的1646nt~1647nt位之间。扬州大学博士学位论文ZJI基因组结构与其它5个NDV毒株相似,也包含6个基因,从3‘端到5’端分别依次编码核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素一神经氨酸酶(HN)和大分子蛋白(L),ZJI株的NP、P、M、F和L这5种蛋白质的氨基酸序列长度与其它5个NDV毒株的相同,而其HN蛋白的氨基酸序列长度带有典型的强毒株特征,为571个氨基酸。ZJI基因组缺乏编码小分子亲水蛋白(SH)的基因,基因组在P基因的484ni位存在一个RNA的编辑位点(从A从GG各G)。除NP基因内多出的这6个核昔酸基序外,ZJI株基因组内各基因的起始、终止及基因间隔区序列的位置及长度均与其它5个NDV毒株高度同源。在ZJI基因组中,NP一P、P一M、M一F、F一HN、HN一L的基因间隔区长度分别为Int(T)、Int(T)、Int(T)、31nt和47nt,其NP一P、P一M、M一F基因间隔区序列与其它5个毒株同源性极高,但F一HN和HN一L基因间隔区序列与其它5个毒株同源性很低。比较刀1和其它5个NDV毒株的基因组各基因编码区核酸序列,发现其它5个毒株的6个结构蛋白基因编码区的核酸序列之间同源性较高,而ZJI株与该5个毒株的6个结构蛋白基因的编码区的核酸序列之间的同源性相对较低。ZJI基因组的Leader序列长55叭肠由ler序列长1 14叭二者均与其它5个毒株相应序列的长度相同。ZJI与另外7个NDV毒株在基因组的0-55nt位的核酸序列同源性为83.6-92.7%,而该7个毒株之间相应序列的同源性为 90.9一100%;ZJI与另外7个NDV毒株在基因组的15073一巧186nt位的核酸序列的同源性为60.5%八石3.2%,而该7个NDV毒株之间该段基因序列的同源性为78.1%~100%。另外ZJI基因组的3‘及5‘末端有连续12个碱基完全互补,而以BeaudetteC为代表的其它7个NDV毒株仅有连续8个碱基完全互补。绘制副粘病毒科的各属病毒代表成员的全基因组序列的遗传发生树,可以将副粘病毒科的病毒分为明显的4个分支。NDv代表株(Lasota, Besildettec和zjl)及AN田V一6在遗传发生树上成为一个独立于腮腺炎病毒属之外的独立分支,而腮腺炎病毒属(Sv反SV41,Muv)、麻疹病毒属(MV, CDV,RP码、副粘病毒属(s eV, bPw3,hPW3)三个属的病毒分别形成3个独立的分支。建议将NDV与A州[PV一6及所有的禽副粘病毒列为副粘病毒科的一个单独的属,并将它命名为新城疫病毒属。2新城疫病毒不同遗传背景毒株NP基因5’末端的序列分析和新城疫病毒各基因的遗传进化在相应于NDV乓asota株全基因组1 1 86ni一1206ni位及22犯nt~2213nt位分别黄勇:鹅源新城疫病毒ZJI株全基因组序列测定及含该毒株全基因组cDNA的转录载体的构建川设计上游和下游引物,运用RT一PCR获取17个NDV毒株基因组的1 1 86nt一2232nt位基因片段。比较23个NDV毒株NP基因5‘端非编码区(1 589nt一1801nt)序列,发现基因Vl~X型毒株在基因组的1646ot一1647nt位多出6个核昔酸,而基因I型一V型毒株没有该特征。这些毒株中既有鹅源毒株,也有鸡源毒株,因此该6碱基的出现不是鹅源或鸡源毒株的特征。不仅中国自上世纪70年代以来分离的毒株均在NP基因内多6个核营酸,而且中国40年代分离的F48及60年代中东分离的IraqAG68也在NP基因内多6个核普酸,因此该6碱基的出现……   
[关键词]:;新城疫病毒;基因组;核衣壳蛋白;转录载体
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:扬州大学2003年