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棉属(Gossypium)特殊腺体发育相关基因和棉酚合成关键酶基因的克隆及棉酚的分析

蔡应繁

  棉酚不仅是棉属植物重要的抗性物质,而且是医药、工业上具有重要应用价值的天然物质。棉酚,尤其是左旋(-)棉酚,具有重要的男性抗生育、抗肿瘤、抗病毒等作用。但棉酚对人和单胃动物有毒,人们迫切希望培育出种子无酚而植株有酚的特殊棉花品种,既可使棉花保持对病虫害的抗性,又能充分利用丰富的棉籽蛋白资源。为了有效调控这一重要的次生代谢物质,学者们长期致力于棉酚及其储藏器官—色素腺体的研究。目前有关亚洲棉棉酚合成关键酶如杜松烯合成酶基因方面的研究较多,然而有关棉花腺体的分子生物学研究尚未见报道,具有左旋(-)棉酚比例高的海岛棉棉酚合成关键酶也未见报道。本研究首先采用高效液相色谱法(HPLC)对多种类型腺体棉棉酚含量进行了比较分析,随之克隆和分析了海岛棉及陆地棉抗黄萎病特殊抗源材料棉酚合成关键酶杜松烯合成酶(cadinene synthase)基因序列及其倍半萜合成酶的保守结构域,进而采用抑制性消减杂交方法(SSH)克隆了显性无腺体海岛棉与有腺体陆地棉的衍生后代突变体“湘棉18”的特殊腺体发育相关的基因。试验首次运用HPLC方法对新近育成的特殊和普通的无腺体陆地棉、特殊(种质)和普通的有腺体陆地棉及海岛棉等多种类型品种材料的棉酚含量进行了比较研究。实验建立了分离度好、准确而快速的棉酚HPLC测定方法,以一反向C_(18)色谱柱为固定相,甲醇-0.5%的醋酸90:10(v/v)为流动相,流速为0.8m Lmin~(-1),经分析,其最低检测限量3μg mL~(-1),精密度(RSD)和精确度(RME)均小于10%,四川大学博士学位论文回收率100.4一103.2%。HPLC分析表明,不同类型腺体品种材料种子的棉酚含量差异极大,两个特殊抗源种质和海岛棉的棉酚含量高;实验的转Bt基因棉的棉酚含量较低;特殊腺体棉“湘棉18’’比普通无腺体棉的种子棉酚含量略高,但仍低于国际卫生标准,其花期顶叶的棉酚含量介于有腺体棉和无腺体棉之间,表明它确是稀有的种子低酚(无腺体)而植株有酚(有腺体)的特殊类型。通过准确的高效液相分析展示出不同腺体类型尤其是特殊腺体棉等具有重要价值的资源,表明这些独特资源材料其重要相关基因和腺体发育等分子机制值得深入研究。第二,采用RT一PCR方法,首次克隆出海岛棉棉酚合成关键酶杜松烯合成酶基因DNA及cDNA序列;并克隆出陆地棉抗黄萎病抗源的棉酚合成关键酶杜松烯合成酶基因的cDNA序列,二序列均在GenBank登记注册。通过与GenBank数据库比较分析,该海岛棉DNA序列的核昔酸和推测的氨基酸与亚洲棉的同源性分别为97%和99%,其核昔酸和推测氨基酸与陆地棉的同源性分别为8踢及95%。分析显示,该序列属于棉属杜松烯合成酶基因A类同源基因。对有腺体陆地棉抗黄萎病抗源材料的棉酚合成关键酶杜松烯合成酶基因的cDNA序列分析表明,其核昔酸和推测的氨基酸序列与亚洲棉的同源的同源性均为99%。分析显示,该序列属于棉属杜松烯合成酶基因C类同源基因。有腺体与无腺体陆地棉的杜松烯合成酶基因之间的同源性也为99%。研究结果表明,对于棉属不同腺体类型的陆地棉或海岛棉材料,不仅其棉酚含量差异极大,而且其棉酚合成关键酶杜松烯合成酶基因也可能存在差异。第三,首次利用新近发展起来的抑制性差减杂交(SuPPre 5 5 ionSubtractiye Hybridization,ssH)技术成功克隆出棉属突变材料特殊腺体发育相关的cDNAs。成功构建了棉属突变材料特殊腺体发育时期SSH差减文库,对所得到的腺体发育形成时期的差减文库进行差异筛选,获得24个差异表达的eDNA克隆。通过地高辛标记的反式Northern和Northern杂交验证,结果显示,的确存在腺体发育时期(时期11)差异表达的基因,有少数在时期n和时期I均表达,而绝大多数在两个时期均不显示信号,甚至与时期n的杂交信号也极弱或没有,这表明通过抑制性差减杂交克隆的基因有相当部分是低丰度的或极低丰度的。但所有的克隆与子叶的cDNA探针杂交均无信号,表明其中很多基因可能Vll四川大学博士学位论文在子叶中不表达。将筛选的24个cDNA克隆进行单向测序,与GenBank中核酸和蛋白序列进行同源比较分析,结果显示,19个是棉属中新发现的,6个是未知蛋白,其中1个在蛋白数据库中未找到任何同源序列:另有一些虽有同源序列,但是其同源区段太短仍难以确定其功能。分析表明,实验获得了与发育调控、信号传导、细胞凋亡等有关联的cDNAs,主要包括具有保守结构域的调控因子、孔蛋白、信号传导蛋白(酶)、推测的腺一体蛋白以及某些未知确切功能的系列未知蛋白,为进一步揭示腺体等发育的分子机制及其与棉酚代谢调控的关系提供了重要信息和建立了基础。……