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苦瓜离体再生体系的建立及开花相关基因的研究

杨满业

  苦瓜(Momordica charantia L.)隶属于葫芦科(cucurbiteae)苦瓜属,它不仅是我国及东南亚各国人民喜爱的传统蔬菜,也是一种重要的药用植物。苦瓜具有清热、解毒、降血糖、抗生育、抗癌和抗艾滋病等功效。已分离纯化出苦瓜凝集素(Momordica Charantia Lectin,MCL);α—苦瓜素(α—Momorcharin);β—苦瓜素(β—Momorcharin);苦瓜抑制剂(Momordica Charantia Inhibitor,MCI)以及核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein,RIP),和苦瓜免疫缺陷病素Ⅰ型抑制剂(Inhibitor of VIH—Ⅰ)等多种苦瓜种仁蛋白。近年来,又从新鲜苦瓜原汁中,提纯出一些新的化学成分,主要为苦瓜素甙、胡萝卜甾醇和抗生育活性成分。但有关苦瓜组织培养的研究很少,其离体繁殖技术至今尚未得到解决,严重影响了珍稀濒危品种的保存和繁殖。本试验通过组织培养首次由外植体形成愈伤组织,愈伤组织分化出不定芽,不定芽产生试管苗,初步建立了一个完整的苦瓜离体繁殖体系。为苦瓜的遗传转化奠定了基础,开辟了新的品种改良途径。并分离得到了苦瓜开花相关基因BAG。试验结果如下:1.苦瓜容易诱导出愈伤组织。外植体在含激素的培养基上产生愈伤组织的过程中对激素种类,用量不敏感,愈伤组织的诱导频率一般为90.0%左右。在愈伤组织起始发生的时间上,幼根、上胚轴、下胚轴、子叶、幼叶等各营养器官的外植体间无明显差异,一般外植体接种四天后开始膨大。愈伤组织的生长速度上,不同组织器官间存在着显著差异。实验表明,幼根、下胚轴、子叶等外植体愈伤组织的生长速度较快;上胚轴、幼叶等外值体的愈伤组织生长速度较慢。四川大学博士学位论文2.苦瓜外植体所形成的愈伤组织从形态学上可分为三种不同的类型:绿色愈伤组织;黄绿色愈伤组织和黄色的愈伤组织。在愈伤组织分化形成不定芽的过程中,植物激素的种类,用量及所用愈伤组织的类型非常重要。绿色愈伤组织和黄绿色愈伤组织在培养基(MS十6一BA+KT)上成功地诱导分化出不定芽,最高分化频率是66.7%;黄色愈伤组织即使在适宜条件下也不能分化出不定芽。3.筛选出培养基(MS+zT 5.0 mgl一‘+K T o.smgl一今较为适合芽的增殖。增殖系数为5一6,且幼芽的基部产生较少的愈伤组织。4.培养基1/2 MS+ZT 0.02 mgl一‘或1/2 MS有助于幼芽离体生根,这两种培养基既有利于幼芽长出新根,又不至于在幼芽基部产生太多的愈伤组织,影响试管苗的移栽成活率,是苦瓜幼芽离体生根较为适合的培养基。5.试管苗经大田移栽试验,成活率约为70.既,其性状与种子苗无明显差异。6.采用RT一PCR和5’末端快速扩增法成功地克隆了苦瓜开花相关基因BA民cDNA全长1001个碱基,包含一个完整的,编码228个氨基酸的开放读码框(OpenReading Frame)。5’末端非翻译区由50个碱基组成。3’末端非翻译区含267个碱基,其中包括由22个碱基组成的ploy(A)‘尾巴及位于833bp处的ploy(A)‘加尾信号(从T拟认)。GenBank登录号为:AY 178837。BA‘基因是拟DS一box基因,含有完整的MADS~box(氨基酸序号1一58)和K一box(氨基酸序号88一193),与多种植物的MADS一box蛋白具有很高的同源性。与黄瓜(cucu刃jssatz’憋)以DS一box Protein‘Z服l口的同源性为95%,与棉花(曲ss动ier hlr万ut姗)MADSbox Protein份旅爪7S二2的同源性为84%,与拟南芥栩厂日bz’故沪Sjs动ali日na)拟DS一box Protein AGLn的同源性为72%;同典型的毗DS一box基因AP3、A夕活0、夕乙沪讨、J倾二脚、‘5万沪,的毗DS一box区域分别有46、38、44、45、34个氨基酸残基相同。同源性分别为80%、66%、76%、78%、59%。Southern杂交分析标明,BA口基因在苦瓜基因组中有2或3个拷贝,属于低拷贝数的基因。Northern杂交和RT一PCR检测证实,BA吞基因在苦瓜花的雄蕊、心皮中大量表达,杂交信号强烈,在其它的组织、器官中没有明显的杂交信号。其中心皮的表达量最为丰富。这种表达模式与控制黄瓜花发育的MADS一box基因cA必的表达模式相同。7.提取苦瓜基因组总DNA,构建DNA步移文库,根据BA口基因的已知序列设计引物,通过染色体步移技术克隆出别口基因起始密码子上游调控序列BAGP。四川大学博士学位论文对BAGP的鉴定和分析表明其具备大多数高等植物启动子的保守元件,预测它对别‘基因的表达具有一定的作用。为鉴定BA‘基因的基本启动子元件,将基因5’侧翼序列做缺失片段分析,利用PCR方法从BAGP中得到三个大小不等两端带有Hz’ndIII、山斑厅I酶切位点的片段BAGPI,BAGPZ和BAGP3,定向插入载体pMGFP4(pBI221改建,报告基因为GFP)中,取代原有的C蒯V35S启动子,构建了由驱动报告基因 GFP的植物表达载体SAGPVI,BAGPVZ和BAGPV3,用于农杆菌介导的拟南芥遗传转化。为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定了基础。8.将苦瓜开花相关基因(BA必的编码区片段定向克隆到pQE一30质粒后,获得重组质粒pQE一BAG。用该重组质粒转化大肠杆菌M15菌株,所获得的阳性转化子经菌落Western检测表达产物。结果表明,在IPTG诱导条?……   
[关键词]:苦瓜;MADS盒基因;启动子;组织培养;植物激素
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:四川大学2003年